Иммуномодулятор метаболитлер шишик микромуитининъ (ШММ) эсас хусусиетидир, амма бир къач истиснадан гъайры, оларнынъ айнылыгъы чокътан белли дегиль. Мында биз юксек дереджели сероз карцинома (ЮДК) хасталарынынъ шишиклеринден ве асцитлеринден шишиклерни ве Т-уджерелерини талиль этип, бу чешит ТМЭ болюклерининъ метаболомыны таптыкъ. Асцит ве шишик укюретлери арасында метаболитлернинъ кенъ фаркълары бар. Асцитнен тенъештирильгенде, шишикке инфильтрация япкъан Т-уджерелери 1-метилникотинамид (МНК) иле эмиетли дереджеде зенгинлешкен. Т-уджерелерде МНК севиеси юксельсе де, никотинамид N-метилтрансферазанынъ (S-аденозилметионинден никотинамидке метил группаларынынъ кечювини катализлеген фермент) экспрессиясы тек фибробластлар ве шишик укюретлеринен сынъырлана. Функциональ джеэттен МНК Т-уджерелерни шишикни тешвикъат этеджек цитокин шишик некрозы факторы альфа чыкъармагъа меджбур эте. Шунынъ ичюн ТМЭ-ден алынгъан МНК Т-уджерелернинъ иммун низамланувына ярдым эте ве инсан раки хасталыгъыны тедавийлемек ичюн потенциаль иммунотерапия нишанесидир.
Шиштен пейда олгъан метаболитлер шишке къаршы иммунитетке терен ингибитор тесир эте билелер, ве олар хасталыкънынъ огге кетмеси ичюн де эсас айдавджы кучь оларакъ хызмет эте биледжегини даа чокъ делиллер косьтере (1). Варбург эффектинден гъайры, сонъки вакъытларда шишик укюретлерининъ метаболизм алыны ве онынъ шишик микромуитининъ (ШММ) иммун алынен багъыны характеризлемек ичюн ишлер башланды. Сычанларнынъ моделлери ве инсан Т-уджерелери узеринде япылгъан араштырмалар глутамин метаболизми (2), оксидатив метаболизми (3) ве глюкоза метаболизми (4) чешит иммун укюретлери алт группаларында мустакъиль арекет эте биледжегини косьтере. Бу ёллардаки бир къач метаболит Т-уджерелернинъ шишикке къаршы вазифесини ингибирлейлер. Тетрагидробиоптерин (ВН4) коферментининъ блокадасы Т-уджерелернинъ пролиферациясына зарар кетире биледжеги, организмде ВН4нинъ артмасы исе CD4 ве CD8 вастасынен шишикке къаршы иммун джевабыны къуветлештире биледжеги исбатланды. Бундан гъайры, кинурениннинъ иммунодепрессив тесирини ВН4 ичирмекнен къуртармакъ мумкюн (5). Изоцитратдегидрогеназа (ИДГ) мутант глиобластомада энантиометаболизм (R)-2-гидроксиглутарат (R-2-HG) секрециясы Т-уджеренинъ активлешмесини, пролиферациясыны ве цитолизини ингибирлей Фаалиет (6). Сонъки вакъытларда гликолизнинъ къошма махсулы олгъан метилглиоксал миелоид асыллы супрессор укюретлери тарафындан мейдангъа кетирильгени ве метилглиоксалнынъ Т-уджереге кочюрильмеси эффектор Т-уджеренинъ фаалиетини ингибирлей биледжеги косьтерильди. Тедавийлевде метилглиоксалнынъ нейтраллештирильмеси миелоидлерден алынгъан супрессор укюретлернинъ (МДСУ) фаалиетини енъип, сычан моделлеринде тешкерюв пункты блокада терапиясыны синергик шекильде къуветлештире биле (7). Бу чалышмалар джеми оларакъ ТМЭ-ден алынгъан метаболитлернинъ Т-уджеренинъ фаалиетини ве фаалиетини низамлавда эсас ролюни къайд этелер.
Т-уджеренинъ дисфункциясы акъкъында йымырталыкъ раки хасталыгъында кенъ таркъалгъан (8). Бу, къысмен гипоксиягъа ве шишикнинъ аномаль къан дамарларына хас олгъан метаболизм хусусиетлеринен багълыдыр (9), бу исе глюкоза ве триптофаннынъ сют экшилиги ве кинуренин киби къошма махсулатларгъа чевирильмесине кетире. Артыкъча экстрацеллюляр лактат интерферон-γ (ИФН-γ) мейдангъа кетирювини эксильте ве миелосупрессив алт группаларнынъ дифференциациясыны тешвикъ эте (10, 11). Триптофаннынъ истималы догърудан-догъру Т-уджеренинъ чокълашувыны ингибирлей ве Т-уджере рецепторларынынъ сигнал берювини ингибирлей (12-14). Бу козетювлерге бакъмадан, иммун метаболизми этрафында чокъ ишлер in vitro Т-уджере культурасында оптимальлештирильген муитлерни къулланып япылды, я да in vivo гомолог сычан моделлеринен сынъырланды, оларнынъ ич бириси инсан рак хасталыкъларынынъ ве Физиологик макро ве микро муитнинъ гетерогенлигини толусынен акс этмей.
Юмурталыкъ раки хасталыгъынынъ умумий хусусиети – бу перитонеаль даркъалув ве асцитнинъ пейда олувыдыр. Асцитте ульке сувунынъ топланмасы хасталыкънынъ инкишаф этмеси ве зайыф прогнознен багълыдыр (15). Хаберлерге коре, бу уникаль болюк гипоксиягъа малик, къан дамарлары эндотелийининъ осьюв факторы (ВЭГФ) ве индоламин 2,3-диоксигеназа (ИДО) юксек севиедедир, Т-регулятор укюретлери ве миелоид ингибитор укюретлери тарафындан инфильтрациялана (15-18). Асцитнинъ метаболизм муити шишикнинъ озюнден фаркълы ола биле, шунынъ ичюн перитонеаль бошлукъта Т-уджерелернинъ янъыдан программаланмасы ачыкъ дегиль. Бундан гъайры, шишик муитинде булунгъан асцит ве метаболитлер арасындаки эсас фаркълар ве гетерогенлик иммун укюретлерининъ инфильтрациясына ве оларнынъ шишиклер узериндеки вазифесине кедер эте биле, шунынъ ичюн илеридеки араштырмалар керек.
Бу меселелерни чезмек ичюн биз чешит ульке тюрлерини (оларнынъ арасында CD4 + ве CD8 + Т улькелери) эм де шишиклернинъ ичинде ве оларнынъ арасында огренмек ичюн сезиджи ульке айырув ве сувлу хроматография тандем масса спектрометриясы (СХ-МС/МС) усулыны ишлеп чыкътыкъ Онынъ метаболитлери айны асцит ве шишик хастасы муитиндеки улькелерни къаплай. Биз бу усулны юксек ольчюли акъынты цитометриясы ве бир улькели РНК секвенсированиеси (scRNA-seq) иле берабер къулланамыз, бу эсас популяцияларнынъ метаболизм статусы акъкъында юксек чезильген портретни темин этмек ичюн. Бу усул шишик Т-уджерелеринде 1-метилникотинамиднинъ (МНК) севиесининъ эмиетли дереджеде арткъаныны косьтере, in vitro теджрибелери исе МНК-нынъ Т-уджеренинъ фаалиетине иммуномодулятор тесири эвельден белли олмагъаныны косьтере. Умумен, бу усул шишиклер ве иммун укюретлери арасындаки озьара метаболизм тесирини ачыкълай ве иммун низамлав метаболитлери акъкъында уникаль бильгилерни бере, бу исе Т-уджере эсасында йымырталыкъ раки иммунотерапиясыны тедавийлемек ичюн файдалы ола биле Тедавийлев имкянлары.
Биз юксек ольчюли акъынты цитометриясыны къулланып, айны вакъытта глюкозанынъ алынмасыны [2-(N-(7-нитрофенил-2-окса-1,3-диаза-4-ил)амино)-2-дезоксиглюкоза (2-NBDG) ве митохондрия фаалиетини [MitoTracker Deep Red, DR,de1 are9] микъдарджа эсапладыкъ. иммун укюретлерини ве шишик укюретлерининъ популяцияларыны айыргъан типик маркерлер (S2 джедвели ве S1A ресими). Бу талиль Т-уджерелерине коре, асцит ве шишик укюретлеринде глюкоза алув севиеси зияде олгъаныны, амма митохондрия фаалиетинде фаркълары аз олгъаныны косьтере. Шиш укюретлерининъ [CD45-EpCAM (EpCAM)+] орталама глюкоза алувы Т-уджерелернинъ учь-дёрт кересидир, CD4 + Т-уджерелернинъ орталама глюкоза алувы исе CD8 + Т-уджерелернинъкиден 1,2 кере зиядедир, бу исе Шиш инфильтрациясы лимфоцитлеринде (ТИЛ) фаркълы метаболизмнинъ ТМЕ талаплары олгъаныны косьтере). Аксине, шишик укюретлериндеки митохондрия фаалиети CD4 + Т укюретлерине бенъзей, эки тюр укюретнинъ де митохондрия фаалиети CD8 + Т укюретлеринден зиядедир (1, В рес.). Умумен, бу нетиджелер метаболизм севиесини косьтере. Шиш укюретлерининъ метаболизм фаалиети CD4 + Т укюретлеринден, CD4 + Т укюретлерининъ метаболизм фаалиети исе CD8 + Т укюретлеринден зиядедир. Бу тесирлерге бакъмадан, ульке тюрлери арасында CD4 + ве CD8 + Т улькелерининъ метаболизм статусы я да оларнынъ асциттеки нисбий нисбетлеринде шишиклернен тенъештирильгенде, ич бир тюрлю изчен фаркъ ёкъ (1С рес.). Аксине, CD45-уджерели фракцияда шишиктеки EpCAM+ улькелерининъ пайы асцитке коре артты (1D рес.). Биз де EpCAM+ ве EpCAM- ульке компонентлери арасында ачыкъ метаболизм фаркъыны козьде туттыкъ. ЭпКАМ+ (шишик) укюретлери ЭпКАМ- укюретлерине коре глюкоза алув ве митохондрия фаалиети зиядедир, бу исе ТМЭде шишик укюретлериндеки фибробластларнынъ метаболизм фаалиетинден чокъ зиядедир (1, Е ве Ф рес.).
(А ве В) Глюкоза алувынынъ (2-НБДГ) орта флюоресценция интенсивлиги (МФИ) (А) ве CD4 + Т-уджерелернинъ митохондрия фаалиети (MitoTracker къою къырмызы) (Б) Репрезентатив графиклер (солда) ве джедвельдеки малюматлар (Сагъда), CD8 + Т-уджерелери ве EpCAM + Т-уджерелери ве EpCAM + CD45-ден шишик улькеси а. В) асцит ве шишикте CD4 + ве CD8 + улькелернинъ (CD3 + Т улькелернинъ) нисбети. Г) Асцит ве шишикте ЭпКАМ + шишик укюретлерининъ пайыны (CD45−). (Е ве Е) EpCAM + CD45-шишик ве EpCAM-CD45-матрицалы глюкоза алув (2-NBDG) (Е) ве митохондрия фаалиети (MitoTracker къою къырмызы) (Е) темсилий графиклер (солда) ве джедвельдеки малюматлар ( Сагъда) Асцит ве шишик укюретлери. Г) Акъынты цитометриясы ярдымынен CD25, CD137 ве PD1 экспрессиясынынъ темсилий графиклери. (Н ве I) CD4 + Т-уджерелерде (Н) ве CD8 + Т-уджерелерде (I) CD25, CD137 ве PD1 экспрессиясы. (J ве K) CCR7 ве CD45RO экспрессиясына эсаслангъан наив, меркезий хатырлав (Tcm), эффектор (Teff) ве эффектор хатырлав (Tem) фенотиплери. Асцит ве шишиклерде CD4 + Т-уджерелернинъ (J) ве CD8 + Т-уджерелернинъ (K) темсилий ресимлери (солда) ве джедвель малюматлары (сагъда). Р къыйметлери чифт t-тест ярдымынен бельгиленген (*Р<0,05, **Р<0,01 ве ***Р<0,001). Сызыкъ уйгъун кельген хасталарны косьтере (n = 6). ФМО, флюоресценция минус бир; МФИ, флюоресценциянынъ орта интенсивлиги.
Илеридеки талиль юксек чезильген Т-уджеренинъ фенотипик статусы арасында башкъа муим фаркъларны косьтере. Шишлерде активлешкен (1 рес., G ден I гедже) ве эффектор хатырлав (1 рес., J ве K) асциттен (CD3 + Т укюретлерининъ нисбети) чокъча расткеле. Айны шекильде, фенотипни активация маркерлерининъ (CD25 ве CD137) ве эксильюв маркерлерининъ [программалангъан ульке олюмининъ бельгиси 1 (PD1)] экспрессиясы иле талиль этмек шуны косьтере ки, бу популяцияларнынъ метаболизм хусусиетлери фаркълы олса да (S1 ресими, В дан Е гедже) , Амма ич бир эмиетли субболизм фаркълары мемориаль я да S1 рес. Ф ден I гедже). Бу нетиджелер машина огретюв усулларыны къулланып, автоматик суретте ульке фенотиплерини тайинлемекнен тасдыкъланды (21), бу исе хастанынъ асцитинде чокъ сайыда кемик илик улькелери (CD45 + / CD3- / CD4 + / CD45RO +) олгъаныны даа да косьтере (S2A рес.). Бутюн белли олгъан ульке чешитлери арасында бу миелоид ульке популяциясы энъ юксек глюкоза алувыны ве митохондрия фаалиетини косьтере (S2 рес., В-ден G-гедже). Бу нетиджелер ГГСК хасталарында асцит ве шишиклерде расткельген чокъ ульке чешитлери арасындаки кучьлю метаболизм фаркъларыны айдынлата.
ТИЛнинъ метабономик хусусиетлерини анъламакъта эсас вазифе – шишиклерден етерли темизликте, кейфиетте ве микъдарда Т-уджере нумюнелерини айырмакъ кереклигидир. Сонъки араштырмалар акъынты цитометриясына эсаслангъан сыралав ве боюнджакъларны зенгинлештирюв усуллары ульке метаболитлерининъ профилинде денъишмелернинъ пейда олувына кетире биледжегини косьтере (22-24). Бу меселени енъмек ичюн биз LC-MS/MS иле талильден эвель джеррахий ёлнен чыкъарылгъан инсан йымырталыкъ раки хасталыгъындан ТИЛни айырмакъ ве айырмакъ ичюн монджукъ зенгинлештирюв усулыны оптималлаштырдыкъ (Материаллар ве усулларгъа бакъынъыз; 2А рес.). Бу протоколнынъ метаболит денъишювлерине умумий тесирини къыймет кесмек ичюн, биз юкъарыдаки боюнджакъ айырув адымындан сонъ сагълам донорлар тарафындан фаальлештирильген Т-уджерелернинъ метаболит профильлерини боюнджакъ айырылмагъан, амма буз устюнде къалгъан улькелернен тенъештирдик. Бу кейфиетни тешкерюв талили бу эки шарт арасында юксек корреляция олгъаныны (r = 0,77), 86 метаболит группасынынъ техникий текрарланувы юксек текрарланувгъа малик олгъаныны косьтере (2В рес.). Шунынъ ичюн бу усуллар ульке тип зенгинлештирювини кечирген улькелерде метаболитлернинъ догъру талилини япып олур, бойлеликнен, ГГСК-да специфик метаболитлерни бельгилемек ичюн биринджи юксек ифадели платформаны темин эте, ве бунынънен инсанларгъа улькенинъ спецификлигини даа терен анъламагъа имкян бере Джинсий метаболизм программасы.
А) магнит боюнджакъларыны зенгинлештирювнинъ схематик схемасы. ЖК-МС/МС иле талиль этмезден эвель, улькелер учь кере арды-сыра магнит боюнджакълары зенгинлештирювинден кечеджеклер я да буз устюнде къалалар. Б) Зенгинлештирюв чешитининъ метаболитлернинъ чокълугъына тесири. Эр бир зенгинлештирюв чешити ичюн учь ольчюнинъ орталамасы ± СЕ. Боз сызыкъ 1:1 мунасебетини косьтере. Кочер ярлыгъында косьтерильген текрарлангъан ольчюлернинъ сыныф ичиндеки корреляциясы (СИК). НАД, никотинамид аденин динуклеотид. В) хаста метаболитлерининъ анализининъ иш акъымынынъ схематик схемасы. Асцит я да шишиклер хасталардан топлана ве криоконсервациялана. Эр бир нумюненинъ кучюк бир къысмы акъынты цитометриясы ярдымынен талиль этильди, къалгъан нумюнелер исе CD4+, CD8+ ве CD45- улькелери ичюн учь тур зенгинлештирювден кечтилер. Бу ульке фракциялары ЖК-МС/МС ярдымынен талиль этильди. Г) стандартлаштырылгъан метаболитлернинъ чокълугъынынъ иссилик харитасы. Дендрограммада Уорднынъ нумюнелер арасындаки Евклид месафелери группалаштырылмасы косьтериле. Д) нумюне метаболит харитасынынъ эсас компонент талили (ЭКТ), эр бир нумюненинъ учь текрарлавыны косьтере, айны хастадан алынгъан нумюнелер бир сызыкънен багълана. Е) хастагъа шартлангъан нумюненинъ метаболит профилининъ ПКА-сы (яни къысмен артыкъчалыкъны къулланмакъ); нумюненинъ чешити къабарыкъ корпуснен сынъырлана. ПК1, эсас компонент 1; ПС2, эсас компонент 2.
Сонъра биз бу зенгинлештирюв усулыны алты ГГСК хастасынынъ биринджи асцит ве шишиклеринде CD4 +, CD8 + ве CD45-уджере фракцияларында 99 метаболитни талиль этмек ичюн къулландыкъ (2С рес., S3А рес. ве S3 ве S4 джедвели). Меракълангъан популяция джанлы улькелернинъ ильк буюк нумюнеси-нинъ 2%-ден 70%-ке къадарыны тешкиль эте, улькелернинъ пайы исе хасталар арасында пек денъише. Бонджларны айыргъан сонъ, меракълангъан зенгинлештирильген фракция (CD4+, CD8+ я да CD45-) орта эсапнен нумюнедеки бутюн джанлы улькелернинъ 85%-ден зиядесини тешкиль эте. Бу зенгинлештирюв усулы инсан шишик токъумаларынынъ метаболизминден ульке популяцияларыны талиль этмеге имкян бере, буны буюк нумюнелерден япмакъ мумкюн дегиль. Бу протоколны къулланып, биз l-кинуренин ве аденозин, бу эки яхшы характеристикалы иммунодепрессив метаболитлернинъ шишик Т-уджерелеринде я да шишик укюретлеринде юксельгенини бельгиледик (С3, В ве С рес.). Демек, бу нетиджелер бизим ульке айырув ве масса спектрометриясы технологиямызнынъ хаста токъумаларында биологик джеэттен муим метаболитлерни тапмакъ ичюн садыкълыгъыны ве къабилиетини косьтере.
Бизим талильимиз де хасталар ичинде ве олар арасында ульке тюрлерининъ кучьлю метаболизм айырылмасыны косьтере (2D рес. ве S4A рес.). Хусусан, башкъа хасталаргъа коре, 70 хастада метаболизмнинъ чешит хусусиетлери пейда олды (2Е рес. ве S4В рес.), бу исе хасталар арасында муим метаболизм гетерогенлиги ола бильгенини косьтере. Шуны къайд этмек керек ки, башкъа хасталаргъа коре (1,2-ден 2 литргедже; S1 джедвели) 70-нджи хастада топлангъан асцитнинъ умумий микъдары (80 мл) даа аз эди. Эсас компонент анализи вакътында хасталарара гетерогенликнинъ идареси (меселя, къысмен артыкъчалыкъ анализини къулланув) ульке тюрлери арасында изчен денъишмелерни косьтере, ульке тюрлери ве/я да микромуит метаболит профилине коре ачыкъ-айдын топлана (2Ф рес.). Ялынъыз метаболитлернинъ талили бу тесирлерни айрыджа къайд этти ве ульке чешитлери ве микромуит арасында муим фаркъларны ачыкълады. Шуны къайд этмек керек ки, козьде тутулгъан энъ экстремал фаркъ МНК ола, о, адет узьре CD45- улькелеринен ве шишикке инфильтрация япкъан CD4+ ве CD8+ улькелеринен зенгинлешкен (3А рес.). CD4 + улькелери ичюн бу тесир энъ ачыкъ корюне, CD8 + улькелердеки МНК да, корюне ки, этраф муитнинъ кучьлю тесирине огърай. Лякин бу муим дегиль, чюнки алты хастадан тек учюни шишикнинъ CD8+ баллларына коре къыймет кесмек мумкюн. МНК-дан гъайры, асцит ве шишиклердеки чешит тюрлю улькелерде ТИЛ-де зайыф характеристикалангъан башкъа метаболитлер де дифференциаль зенгиндир (С3 ве С4 рес.). Демек, бу малюматлар илеридеки араштырмалар ичюн иммуномодулятор метаболитлернинъ перспективли бир джемисини ачыкълай.
А) Асцит ве шишиктен CD4+, CD8+ ве CD45- улькелеринде МНКнынъ нормаллештирильген микъдары. Къуту графикинде медиана (сызыкъ), квартильлерара диапазон (рамка шарнири) ве малюмат диапазоны, квартильлерара диапазоннынъ 1,5 кересине къадар (рамка мыйыкъ) косьтериле. Хастанынъ материаллары ве усулларында тариф этильгени киби, Р къыйметини бельгилемек ичюн хастанынъ лимма къыйметини къулланынъыз (*Р<0,05 ве **Р<0,01). Б) МНК метаболизмининъ схематик схемасы (60). Метаболитлер: S-аденозил-1-метионин; САХ, С-аденозин-1-гомоцистеиннинъ; Н. А., никотинамид киби; МНК, 1-метилникотинамид; 2-ПЙ, 1-метил- 2-пиридон-5-карбоксамид; 4-ПЙ, 1-метил-4-пиридон-5-карбоксамид; НР, никотинамид рибозасы; НМН, никотинамиднинъ мононуклеотидлери. Ферментлер (ешиль): ННМТ, никотинамид N-метилтрансфераза; СИРТ, сиртуинлер; НАМПТ, никотинамид фосфорибозил трансферазасы; АОХ1, альдегид оксидазасы 1; НРК, никотинамид рибозид киназасы; НМНАТ, никотинамид моно Нуклеотид аденилат трансферазасы; Pnp1, пурин нуклеозид фосфорилазасы. В) асцитнинъ (боз) ве шишикнинъ (къырмызы; n = 3 хаста) scRNA-seq t-SNE. Г) scRNA-seq къулланып белли этильген чешит ульке популяцияларында ННМТ экспрессиясы. Д) SK-OV-3, инсан эмбриональ богъдай (HEK) 293T, Т-уджерелерде ве МНК-нен ишленген Т-уджерелерде NNMT ве AOX1 экспрессиясы. Къатлангъан ифаде СК-ОВ-3-ке нисбетен косьтериле. СЭМ иле экспрессия шекили косьтериле (n = 6 сагълам донор). 35-тен буюк олгъан Кт къыйметлери тапылмаз (УД) сайыла. Е) 8 мМ МНК иле ишленген СК-ОВ-3, ГЭК293Т, Т-уджерелерде ве Т-уджерелерде SLC22A1 ве SLC22A2 экспрессиясы. Къатлангъан ифаде СК-ОВ-3-ке нисбетен косьтериле. СЭМ иле экспрессия шекили косьтериле (n = 6 сагълам донор). 35-тен буюк олгъан Кт къыйметлери тапылмаз (УД) сайыла. З) МНК иле 72 саат инкубациядан сонъ активлештирильген сагълам донор Т-уджерелеринде ульке МНК микъдары. СЭМ иле экспрессия шекили косьтериле (n = 4 сагълам донор).
МНК метил группасыны S-аденозил-1-метионинден (САМ) никотинамидке (НА) никотинамид N-метилтрансфераза (ННМТ; 3В рес.) ярдымынен никотинамидке (НА) кечирюв ёлунен мейдангъа кетириле. ННМТ инсаннынъ чешит рак хасталыкъларында зияде экспрессиялана ве пролиферация, инвазия ве метастазларнен багълыдыр (25-27). ТМЭде Т-уджерелерде МНК менбасыны даа яхшы анъламакъ ичюн, биз учь ГГСК хастасынынъ асцит ве шишиклеринде ульке тюрлери боюнджа ННМТ экспрессиясыны характеризлемек ичюн scRNA-seq къулландыкъ (S5 джедвели). Тахминен 6500 улькенинъ талили асцит ве шишик муитлеринде ННМТ экспрессиясы тахмин этильген фибробласт ве шишик улькелери популяцияларынен сынъырлангъаныны косьтере (3, С ве Д рес.). Шуны къайд этмек керек ки, ПТПРК (CD45 +) ифаделеген ич бир популяцияда ачыкъ-айдын ННМТ экспрессиясы ёкъ (3D рес. ве S5А рес.), бу исе метаболит спектринде тапылгъан МНК Т-уджерелерге кирсетильгенини косьтере. Альдегид оксидаза 1 (АОХ1) экспрессиясы МНК-ны 1-метил-2-пиридон-5-карбоксамидке (2-ПИР) я да 1-метил-4-пиридон-5-карбоксамидке (4-ПИР) чевире; 3В ресими) де COL1A1 экспрессиясы олгъан фибробластларнынъ популяциясынен сынъырлана (S5А ресими), олар бераберликте Т-уджерелерде адеттеки МНК метаболизми къабилиети олмагъаныны косьтере. Бу МНК-нен багълы генлернинъ экспрессия шекили ГГСК хасталарындан асциттен алынгъан экинджи мустакъиль ульке малюматлары топламы ярдымынен тасдыкъланды (S5B рес.; n = 6) (16). Бундан гъайры, МНК иле ишленген сагълам донор Т-уджерелернинъ микъдарий полимераз зынджырлы реакциясы (qPCR) талили, контроль SK-OV-3 йымырталыкъ шишик укюретлеринен тенъештирильгенде, NNMT я да AOX1 деерлик ифаделенмегенини косьтере (3Е рес.). Бу бекленильмеген нетиджелер МНК фибробластлардан я да шишиклерден ТМЭде янаша Т-уджерелерге чыкъарыла биледжегини косьтере.
Намзетлернинъ арасында иритиджи ташыйыджы 22 (СЛК22) къорантасы (СЛК22А1, СЛК22А2 ве СЛК22А3) тарафындан кодлангъан 1-ден 3-кедже органик катион ташыйыджылары къорантасы (ОКТ1, ОКТ2 ве ОКТ3) олса да, МНК-нынъ потенциаль ташыйыджылары даа белли дегиль (28). Сагълам донор Т-уджерелеринден мРНК-нынъ КПЦР-и SLC22A1 экспрессиясынынъ алчакъ севиелерини, амма SLC22A2нинъ тапылмагъан севиелерини косьтере, бу исе эдебиятта эвельден хабер этильгенини тасдыкълай (3Ф рес.) (29). Аксине, SK-OV-3 йымырталыкъ шишик улькеси эки ташыйыджынынъ да юксек севиесини ифаде эте эди (3Ф рес.).
Т-уджерелернинъ ябанджы МНК-ны озьлерине чекмек къабилиетине малик олгъаныны тешкермек ичюн, сагълам донор Т-уджерелери 72 саат девамында чешит концентрациялы МНК-нынъ иштирагинде осьтюрильди. Экзоген МНК олмагъанда, МНК-нынъ улькевий мундериджесини тапмакъ мумкюн дегиль (3Г рес.). Лякин экзоген МНК иле ишленген активлештирильген Т-уджерелерде улькелерде МНК микъдары дозагъа коре арткъаныны косьтере, 6 мМ МНК-гъа къадар (3Г рес.). Бу нетидже, транспортер экспрессиясынынъ алчакъ севиесине ве ульке ичиндеки МНК метаболизми ичюн месуль олгъан эсас ферментнинъ олмагъанына бакъмадан, ТИЛ даа МНКны къабул эте биледжегини косьтере.
Хасталарнынъ Т-уджерелериндеки метаболитлернинъ спектри ве in vitro МНК ютув экспериментлери рак хасталыгъынен багълы фибробластлар (КАФ) МНК чыкъарув имкяныны арттыра ве шишик укюретлери ТИЛнинъ фенотипини ве вазифесини низамлай билелер. МНК-нынъ Т-уджерелерге тесирини бельгилемек ичюн сагълам донор Т-уджерелери МНК олгъанда я да олмагъанда in vitro шекильде фаальлештирильди, оларнынъ пролиферациясы ве цитокинлернинъ мейдангъа келюви къыймет кесильди. Энъ юксек дозада МНК къошулгъан сонъ 7 кунь кечкен сонъ, популяциянынъ эки къат артув сайысы орта дереджеде эксильди, бутюн дозаларда исе гъайрет сакъланды (4А рес.). Бундан гъайры, экзоген МНК-ны тедавийлев шишик некрозы факторы-α (ТНФα; 4В рес.) ифаделеген CD4 + ве CD8 + Т-уджерелернинъ пайыны арттырувгъа кетире. Аксине, CD4 + Т-уджерелерде ИФН-γнинъ ич мейдангъа кетирильмеси эмиетли дереджеде эксильди, амма CD8 + Т-уджерелерде ёкъ, интерлейкин 2-де исе ич бир тюрлю эмиетли денъишюв олмады (ИЛ-2; 4, С ве Д рес.). Шунынъ ичюн бу МНК-нен ишленген Т-уджере культураларындан алынгъан супернатантыларнынъ ферментлернен багълы иммуносорбент анализи (ИФА) ТНФα эмиетли дереджеде арткъаныны, ИФН-γ эксильгенини ве ИЛ-2 денъишмегенини косьтере (4 рес., Е-ден Г-гедже). . ИФН-γ нинъ эксильмеси МНК Т-уджерелернинъ шишикке къаршы фаалиетини ингибирлемекте роль ойнай биледжегини косьтере. МНК-нынъ Т-уджере вастасынен цитотоксикликке тесирини импульслемек ичюн, сагълам донор периферик къан ПБМС (мононуклеар къан ПБМС) укюретлери тарафындан идаре этильген фолат рецепторы α ве CAR-T (GFP) нишанлангъан химер антиген рецепторы Т (FRα-CAR-T) укюретлери мейдангъа кетириле. CAR-T улькелери 24 саат девамында МНК иштирагинде осьтюрильди, сонъра исе 10:1 эффектор ве нишан нисбетинде фолат рецепторы α ифаделеген инсан SK-OV-3 йымырталыкъ шишик улькелеринен берабер осьтюрильди. МНК иле тедавийлев FRα-CAR-T улькелерининъ ольдюрюв фаалиетининъ эмиетли дереджеде эксильмесине кетире, бу исе аденозиннен тедавийленген FRα-CAR-T улькелерине бенъзей эди (4Н рес.).
А) 7-нджи куню догърудан-догъру культурадан умумий омюрге къабилиетли улькелернинъ сайысы ве популяциянынъ эки къат артмасы (ПД).Гистограммада алты сагълам донорнынъ орта + СЭМ косьтериле. Энъ аздан n = 3 мустакъиль теджрибеден малюматны косьтере. (В - Д) Т-уджерелерни 7 кунь девамында озь уйгъун МНК концентрацияларында активлештирмек ичюн CD3/CD28 ве IL-2 къулланылды. Анализден эвель улькелерни 4 саат девамында GolgiStop иле ПМА/иономициннен стимуляция эттилер. Т-уджерелерде ТНФα (В) ифаделенюви. Джанлы улькелерде ТНФα экспрессиясынынъ нумюневий ресими (солда) ве джедвель малюматлары (сагъда). Т-уджерелерде ИФН-γ (С) ве ИЛ-2 (Д) экспрессиясы. Цитокинлернинъ экспрессиясы акъынты цитометриясы ярдымынен ольченильди. Гистограммада орталама (n = 6 сагълам донор) + СЭМ косьтериле. Р къыйметини бельгилемек ичюн дисперсиянынъ бир тарафлы талилини ве текрарлангъан ольчюлерни (*Р<0,05 ве **Р<0,01) къулланынъыз. Энъ аздан n = 3 мустакъиль теджрибеден малюматны косьтере. (Е дан Г гедже) Т-уджерелерни 7 кунь девамында озь уйгъун МНК концентрацияларында активлештирмек ичюн CD3/CD28 ве IL-2 къулланылды. Орталыкъ ПМА/иономицин стимуляциясындан 4 саат эвель ве сонъ топланды. ТНФα (Е), ИФН-γ (Ф) ве ИЛ-2 (Г) концентрациялары ИФА ярдымынен ольченильди. Гистограммада орталама (n = 5 сагълам донор) + СЭМ косьтериле. Р къыймети дисперсиянынъ бир тарафлы талили ве текрарлангъан ольчюлер ярдымынен бельгиленди (*Р<0,05). Нокъталы сызыкъ тапылувнынъ тапылув сынъырыны косьтере. З) Уджейренинъ лизис анализи. FRα-CAR-T я да GFP-CAR-T улькелери 24 саат девамында аденозин (250 мкМ) я да МНК (10 мМ) иле ерлештирильди, я да ишленмейип къалдырылды (Ctrl). СК-ОВ-3 улькелерининъ фаиз ольдюрильмеси ольченильди. Уэлчнинъ t тести иле бельгиленген Р къыймети (*Р<0,5 ве **Р<0,01).
МНК-гъа багълы ТНФα экспрессиясынынъ низамланувы акъкъында механистик анълайыш къазанмакъ ичюн МНК-нен ишленген Т-уджерелернинъ ТНФα мРНК-сындаки денъишмелер къыймет кесильди (5А рес.). МНК иле тедавийленген сагълам донор Т-уджерелеринде ТНФα транскрипциясы севиелери эки кере арткъаныны косьтере, бу исе МНК ТНФα транскрипциясынынъ низамланувына багълы олгъаныны косьтере. Бу мумкюн олгъан низамлайыджы механизмни тешкермек ичюн, ТНФα-ны низамлагъан эки белли транскрипция факторы, яни активлештирильген Т-уджере ядро ​​факторы (НУАТ) ве специфик 1-нджи бельги (Sp1) МНК-нынъ проксималь ТНФα промоторына багъланувына джевап оларакъ къыймет кесильди ( 30 ). ТНФα промоторында 6 белли олгъан НФАТ багъланув ери ве 2 Sp1 багъланув ери бар, олар бир ерде къаплана [5'къапакътан -55 база чифтлери (бп)] (30). Хроматин иммунопреципитациясы (ХИП) МНК иле ишленгенде Sp1нинъ ТНФα промоторына багъланмасы учь кере арткъаныны косьтере. НФАТ-нынъ кирсетильмеси де эмиетини арттырды ве якъынлашты (5В рес.). Бу малюматлар МНК Sp1 транскрипциясы вастасынен ТНФα экспрессиясыны, азджа исе НФАТ экспрессиясыны низамлагъаныны косьтере.
А) МНКсыз осьтюрильген Т-уджерелернен тенъештирильгенде, МНК иле ишленген Т-уджерелерде ТНФα экспрессиясынынъ къат денъишмеси. СЭМ иле экспрессия шекили косьтериле (n = 5 сагълам донор). Энъ аздан n = 3 мустакъиль теджрибеден малюматны косьтере. Б) НФАТ ве Sp1 сонъ 8 мМ МНК иле я да олмадан ишленген Т-уджерелернинъ ТНФα промоторы (Ctrl) ве ПМА/иономицин стимуляциясынен 4 саат девамында бирлештирильди. Иммуноглобулин G (IgG) ве H3 иммунопреципитация ичюн менфий ве мусбет контроль оларакъ къулланылды. ЧИПнинъ микъдарыны эсаплав шуны косьтере ки, МНК иле ишленген улькелерде Sp1 ве NFAT нинъ TNFα промоторына багъланмасы контроль улькеге коре бир къач кере артты. Энъ аздан n = 3 мустакъиль теджрибеден малюматны косьтере. Р къыймети бир къач t-тестлер ярдымынен бельгилене (*** Р <0,01). В) ГГСК-нинъ асцитине коре, Т-уджерелери (цитотоксик олмагъан) шишикте ТНФнинъ экспрессиясы арткъаныны косьтере. Ренъклер чешит хасталарны ифаде этелер. Косьтерильген улькелер 300-ге къадар тасавурлы шекильде сечильди ве зияде сызувны сынъырламакъ ичюн джиттерленди (** Padj = 0,0076). Г) йымырталыкъ раки хасталыгъына къаршы МНК-нынъ теклиф этильген модели. МНК ТМЭде шишик укюретлеринде ве фибробластларда мейдангъа келе ве Т укюретлери тарафындан къабул этиле. МНК Sp1нинъ ТНФα промоторына багъланувыны арттыра, бу исе ТНФα транскрипциясынынъ ве ТНФα цитокинининъ мейдангъа келювининъ артмасына кетире. МНК да ИФН-γнинъ эксильмесине себеп ола. Т-уджеренинъ фаалиетини ингибирлемек ольдюрюв къабилиетининъ эксильмесине ве шишикнинъ тез осьмесине кетире.
Хаберлерге коре, ТНФα ог ве аркъагъа багълы шишикке къаршы ве шишикке къаршы тесирге малик, амма онынъ йымырталыкъ раки хасталыгъынынъ осьмесине ве метастазланувына ярдым этмекте белли ролю бар (31-33). Хаберлерге коре, йымырталыкъ раки хасталарында асцит ве шишик токъумаларында ТНФα концентрациясы яхшы ниетли токъумалардакиден зиядедир (34-36). Механизм джеэтинден ТНФα лейкоцитлернинъ фаальлешмесини, фаалиетини ве чокълашувыны низамлай, рак лейкоцитлерининъ фенотипини денъиштире биле (37, 38). Бу тапмаджаларгъа мувафыкъ оларакъ, дифференциаль ген экспрессиясынынъ талили шишик токъумаларында Т-уджерелерде ТНФ асцитке коре эмиетли дереджеде юксельгенини косьтере (5С рес.). ТНФ экспрессиясынынъ артмасы тек цитотоксик олмагъан фенотипке малик Т-уджере популяцияларында корюнди (С5А рес.). Умумен, бу малюматлар МНК-нынъ ГГСК-да эки иммунодепрессив ве шишикни тешвикъат этеджек тесирлери олгъаны фикирини тасдикълай.
Акъынты цитометриясы эсасында флюоресцент маркировка ТИЛ метаболизмини огренмек ичюн эсас усул олды. Бу араштырмалар периферик къан лимфоцитлеринен я да экинджи дереджели лимфоид мучелерден кельген Т-уджерелеринен тенъештирильгенде, сычан ве инсан ТИЛ-леринде глюкозаны къабул этмеге зияде мейиль олгъаныны (4, 39) ве митохондриянынъ функциясы яваш-яваш гъайып олгъаныны косьтере (19, 40). Бу тедкъикъатта бойле нетиджелерни козьде тутсакъ да, эсас инкишаф айны резекция этильген шишик токъумасындан шишик укюретлери ве ТИЛнинъ метаболизмини тенъештирмектир. Бу эвельки хаберлернинъ базыларына мувафыкъ оларакъ, асцит ве шишиклерден шишик (CD45-EpCAM +) укюретлери CD8 + ве CD4 + Т укюретлерине коре глюкозанынъ юксек алувыны косьтере, бу исе шишик укюретлерининъ глюкозанынъ юксек алувыны Т укюретлеринен тенъештирмек мумкюн олгъаныны тасдикълай. Т-уджере ярышы акъкъында анълам. ТМЭ. Лякин шишик укюретлерининъ митохондрия фаалиети CD8 + Т укюретлеринден зиядедир, амма митохондрия фаалиети CD4 + Т укюретлерининъ фаалиети кибидир. Бу нетиджелер шишик укюретлери ичюн оксидатив метаболизмнинъ муим олгъаны акъкъында пейда олгъан мевзуны пекителер (41, 42). Олар да CD8 + Т-уджерелери CD4 + Т-уджерелерине коре оксидатив дисфункциягъа зияде сезимли ола биледжегини я да CD4 + Т-уджерелери митохондрия фаалиетини сакълап къалмакъ ичюн глюкозадан гъайры углерод менбаларыны къуллана биледжегини тасавур этелер (43, 44). Шуны къайд этмек керек ки, биз асцитте CD4 + Т эффекторлары, Т эффектор хатырасы ве Т меркезий хатырлав укюретлери арасында глюкоза алувында я да митохондрия фаалиетинде ич бир фаркъ козьде тутмадыкъ. Айны шекильде, шишиклердеки CD8 + Т-уджерелернинъ дифференциация вазиети глюкоза алувындаки денъишмелернен ич бир алякъасы ёкъ, бу исе in vitro тарзында осьтюрильген Т-уджерелер ве in vivo тарзында инсан ТИЛ-и арасындаки эмиетли фаркъны айдынлата (22). Бу козетювлер тарафсыз автоматик ульке популяциясыны айырувнынъ къулланылувынен де тасдыкъланды, бу исе шишик улькелерине коре глюкоза алув ве митохондрия фаалиети зияде олгъан CD45 + / CD3- / CD4 + / CD45RO + улькелернинъ зияде олгъаныны, амма оларнынъ Метаболизм фааль ульке популяциясы олгъаныны ачыкълады. Бу популяция scRNA-seq анализинде белли олгъан миелоид супрессор укюретлерининъ я да плазмоцитоид дендрит укюретлерининъ тахминли субпопуляциясыны ифаде эте биле. Буларнынъ экиси де инсан йымырталыкъ шишиклеринде раст кельген олса да [45], оларгъа даа керек Илеридеки ишлер бу миелоид субпопуляцияны тасвир этмектир.
Акъынты цитометриясына эсаслангъан усуллар ульке тюрлери арасында глюкоза ве оксидатив метаболизмнинъ умумий фаркъларыны айдынлата бильсе де, ТМЭде митохондрия метаболизми ичюн глюкоза я да башкъа углерод менбалары иле чыкъарылгъан догъру метаболитлер даа белли олмады. Берильген ТИЛ алт группасына метаболитлернинъ барлыгъыны я да ёкълугъыны тайинлемек ичюн кесильген токъумадан ульке популяциясыны темизлемек керек. Демек, бизим масса спектрометриясынен бирлешкен ульке зенгинлештирюв усулымыз хаста нумюнелерини келиштирювде Т ульке ве шишик ульке популяцияларында дифференциаль зенгинлешкен метаболитлер акъкъында бильгилерни бере биле. Бу усулнынъ флюоресценциянен фаальлештирильген улькелерни сыралавдан имтиязлары олса да, белли бир метаболит китапханелерине табиий тургъунлыкъ ве/я да тез айланув сурьаты себебинден тесир эте биле (22). Бунъа бакъмадан, бизим усулымыз эки танылгъан иммунодепрессив метаболитни, аденозин ве кинуренинни айырып олды, чюнки олар нумюне чешитлери арасында пек денъишелер.
Бизим шишиклернинъ ве ТИЛ алт чешитлерининъ метабономик талильимиз йымырталыкъларнынъ ТМЭ-синде метаболитлернинъ ролю акъкъында даа чокъ малюмат бере. Биринджиден, акъынты цитометриясы ярдымынен шишиклер ве CD4 + Т-уджерелери арасында митохондрия фаалиетинде ич бир фаркъ олмагъаныны бельгиледик. Лякин LC-MS/MS анализи бу популяциялар арасында метаболитлернинъ чокълугъында муим денъишмелерни косьтере, бу исе ТИЛ метаболизми ве онынъ умумий метаболизм фаалиети акъкъында нетиджелерни мукъайтлыкънен талиль этмекни талап эте. Экинджиден, МНК шишиклерде дегиль де, асцитлерде CD45-уджерелери ве Т-уджерелери арасында энъ буюк фаркъ олгъан метаболиттир. Демек, компартментализация ве шишикнинъ ерлешмеси ТИЛ метаболизмине чешит тесир эте биле, бу исе берильген микромуитте ола бильген гетерогенликни айдынлата. Учюнджиден, МНК чыкъаргъан ННМТ ферментининъ экспрессиясы эсасен шишик укюретлери олгъан КАФ иле сынъырлана, амма шишиктен алынгъан Т укюретлеринде тапыла бильген МНК севиелери козьге чарпа. Овариаль КАФ-та ННМТнинъ зияде экспрессиясы белли бир рак хасталыгъыны тешвикъат этеджек тесирге маликтир, бу къысмен КАФ метаболизмини, шишикнинъ инвазиясыны ве метастазларыны тешвикъат этмекнен багълыдыр (27). ТИЛнинъ умумий севиеси орта олса да, КАФ-та ННМТнинъ ифаделенмеси рак геномы атласы (ТГА) мезенхималы алт типинен якъындан багълыдыр, бу исе зайыф прогнознен багълыдыр (27, 46, 47). Ниает, МНК-нынъ парчаланувындан месуль олгъан АОХ1 ферментининъ экспрессиясы да КАФ популяциясынен сынъырлана, бу исе Т-уджерелерде МНК-ны метаболизм япмакъ къабилиети олмагъаныны косьтере. Бу нетиджелер бойле фикирни тасдикълай ки, бу тапмаджаны тасдыкъламакъ ичюн илеридеки ишлер керек олса да, Т-уджерелерде МНК-нынъ юксек севиеси иммунодепрессив КАФ микромуитининъ барлыгъыны косьтере биле.
МНК ташыйыджыларынынъ экспрессия севиеси алчакъ олгъаныны ве МНК метаболизминде иштирак этиджи эсас акъикъатларнынъ тапылмагъан севиелерини козь огюне алгъанда, Т-уджерелерде МНК-нынъ олмасы бекленильмегендир. Эки мустакъиль когортанынъ scRNA-seq анализи ве макъсатлы qPCR ярдымынен не NNMT, не де AOX1 тапылмады. Бу нетиджелер МНК Т-уджерелери тарафындан синтез этильмегенини, амма этрафтаки ТМЭ-ден озьлештирильгенини косьтере. In vitro теджрибелери Т-уджерелери экзоген МНК топламагъа ынтылгъанларыны косьтере.
Бизим in vitro теткъикъатларымыз экзоген МНК Т-уджерелерде ТНФα экспрессиясыны индюкация эте ве Sp1нинъ ТНФα промоторына багъланувыны къуветлештире. ТНФα эм шишикке къаршы, эм де шишикке къаршы функцияларгъа малик олса да, йымырталыкъ ракъында ТНФα йымырталыкъ раки хасталыгъынынъ осьмесине ярдым эте биле (31-33). ТНФα-нынъ йымырталыкъ шишик улькелери культурасында нейтраллештирильмеси я да сычан моделлеринде ТНФα сигналынынъ ёкъ этильмеси ТНФα вастасынен ялынъызлыкъ цитокинлерининъ мейдангъа келювини яхшылаштырмакъ ве шишикнинъ осьмесини ингибирлемек мумкюн (32, 35). Демек, бу алда ТМЭ-ден алынгъан МНК аутокрин иллеси вастасынен ТНФα-гъа багълы механизм вастасынен ялынъызлыкъкъа къаршы метаболит оларакъ чалышып, йымырталыкъ раки хасталыгъынынъ пейда олувына ве даркъалувына ярдым эте биле (31). Бу имкянгъа эсасланып, ТНФα блокадасы йымырталыкъ раки хасталыгъынынъ потенциаль тедавийлев вастасы оларакъ огрениле (37, 48, 49). Бундан гъайры, МНК CAR-T укюретлерининъ йымырталыкъ шишик укюретлерине къаршы цитотоксиклигини боза ве бу МНК вастасынен иммун бастырувына даа бир делиль кетире. Бу нетиджелерни джеми оларакъ, шишиклер ве КАФ укюретлери МНК-ны укюреттен тыш ТМЭ-ге чыкъаргъан бир моделни теклиф этелер. (i) ТНФ-индукциялангъан йымырталыкъ раки осьмесини тешвикъат этмек ве (ii) МНК-индукциялангъан Т-уджеренинъ цитотоксик фаалиетини ингибирлемек вастасынен бу эки шишик тесири ола биле (5D рес.).
Нетиджеде, тез ульке зенгинлештирюв, бир улькели сыраламакъ ве метаболизм профильлештирюв комбинациясыны къулланып, бу чалышма ГГСК хасталарында шишиклер ве асцит улькелери арасындаки буюк иммунометаболомик фаркъларны ачыкълады. Бу эр тарафлама талиль Т-уджерелери арасында глюкоза алувында ве митохондрия фаалиетинде фаркълар олгъаныны косьтере ве МНК-ны укюретсиз автоном иммунитетни низамлайыджы метаболит оларакъ бельгилей. Бу малюматлар ТМЭ инсан рак хасталыкъларында Т-уджере метаболизмине насыл тесир эте, бунъа тесир эте. Т-уджерелер ве рак укюретлери арасында гъыдалы мадделер ичюн догърудан-догъру ярыш олгъаны акъкъында хаберлер берильсе де, метаболитлер шишикнинъ прогрессивлешмесине ярдым этмек ве, бельки де, эндоген иммун джевапларыны бастырмакъ ичюн догърудан-догъру регуляторлар вазифесини де беджере билелер. Бу низамлайыджы метаболитлернинъ функциональ ролюнинъ илеридеки тарифи шишикке къаршы иммун джевабыны къуветлештирмек ичюн альтернатив стратегиялар ачмакъ мумкюн.
Хасталарнынъ нумюнелери ве клиник малюматлар Канада токъума хазинелери агъындан сертификатлангъан БС рак шишик токъума хазинеси вастасынен алынды. Б.С. Нумюнелер сертификатлы Биобанкта (BRC-00290) сакълана. Хастанынъ тафсилятлы хусусиетлери S1 ве S5 джедвельлерде берильген. Криоконсервация ичюн скальпель ярдымынен хастанынъ шишик нумюнеси механик ёлнен парчалана ве сонъра оны 100 микронлыкъ фильтрден кечирип, бир улькели суспензия алалар. Хастанынъ асцитини 4°С температурада 10 дакъкъа девамында 1500 айланув/дакъкъада центрифугагъа къойып, улькелерни пеллетледилер ве устюндеки сувны чыкъардылар. Шиш ве асциттен алынгъан улькелер 50% сыджакътан инактивациялангъан инсан АВ къан плазмасында (Sigma-Aldrich), 40% RPMI-1640 (Thermo Fisher Scientific) ве 10% диметилсульфоксидте криоконсервация этильди. Бу сакълангъан бир улькели суспензиялар иритип, ашагъыда тасвирленген метаболомика ве метаболитлерни бельгилемек ичюн къулланылды.
Толу муит 0,22 мкм фильтрленген 50:50 къошулгъан RPMI 1640: AimV дан ибарет. RPMI 1640 + 2,05 мМ л-глутамин (Термо Фишер Сайентифик) 10% сыджакътан инактивациялангъан инсан АВ къан плазмасына (Фигма-Ольдрих), 12,5 мМ Гепес (Термо Фишер Сайентифик), 2 мМ л-глутамин (Термо Фишер Сайентифик) Фишер С. Стрептомицин (ПенСтреп) иляджы (Thermo Fisher Scientific) ве 50 мкМ-меркаптоэтанол. AimV (Invitrogen) 20 мМ Гепес (Термо Фишер Сайентифик) ве 2 мМ л-глутамин (Термо Фишер Сайентифик) иле къошула. Акъынты цитометрининъ боялав буфери 0,22 мкм фильтрленген фосфат буферли физиологик еринде (ПБС; Invitrogen) ибарет олып, 3% сыджакътан инактивациялангъан АВ инсан къан плазмасына (Сигма) къошулды. Уджейре зенгинлештирюв буфери 0,22 мкм фильтрленген ПФС-тен ибарет ве 0,5% сыджакътан инактивациялангъан инсан АВ къан плазмасына (Сигма-Ольдрих) толдурыла.
37°С температурадаки толу муитте 30 дакъкъа девамында 10 нМ МТ ДР ве 100 мкМ 2-НБДГ иле улькелерни бояладылар. Сонъра 4°С температурада 15 дакъкъа девамында улькелерни омюрге къабилиет боясы eF506 иле бояладылар. Уджейрелерни FC Block (eBioscience) ве Brilliant Stain Buffer (BD Biosciences) махсулатларында гъайрыдан суспензия этип, акъынты цитометрининъ боялав буферинде (истисалджынынъ косьтергичи боюнджа) иритип, ода араретинде 10 дакъкъа девамында инкубация этинъиз. 4°С температурада 20 дакъкъа девамында акъынты цитометриясы боялав буферинде улькелерни антителоларнынъ бир сырасынен (С2 джедвели) бояламакъ керек. Анализден эвель улькелерни акъынты цитометриясы боялав буферинде (Cytek Aurora; 3L-16V-14B-8R конфигурациясы) гъайрыдан суспензия этинъиз. Уджейрелернинъ сайысы акъкъында малюматны талиль этмек ичюн SpectroFlo ве FlowJo V10 программаларыны къулланынъыз, малюматны яратмакъ ичюн исе GraphPad Prism 8 программаларыны къулланынъыз. 2-НБДГ ве МТ ДРнинъ орта флюоресценция интенсивлиги (МФИ) лог-нормаллештирильди, сонъра уйгъунлашкъан хасталарны эсапкъа алмакъ ичюн статистик талиль ичюн чифт t тести къулланылды. 40-тан аз вакъиа олгъан бутюн популяцияларны талильден чыкъармакъ; статистик талиль ве малюматны корьгезмекни япмаздан эвель эр анги менфий къыйметлер ичюн 1 МФИ къыйметини кирсетинъиз.
Юкъарыдаки процесс панелининъ эльнен къапу стратегиясыны толдурмакъ ичюн, биз FlowJo-да олю улькелерни ёкъ этмектен сонъ автоматик суретте улькелерни популяциягъа тайинлемек ичюн шекиль сынъырлав тереги (FAUST) (21) тарафындан толу аннотацияны къулландыкъ. Биз чыкъышны эльнен идаре этемиз, янълыш айырылгъан киби корюнген популяцияларны (PD1+ PD1-шишик укюретлеринен бирлештирмек) ве сакъланып къалгъан популяцияларны бирлештирмек ичюн. Эр бир нумюнеде орта эсапнен 2%-ден зияде ульке бар, эписи олып 11 популяция ичюн.
ПБМК-ны лейкоцитлерни айырув махсулатларындан айырмакъ ичюн фиколл градиент сыкълыгъы центрифугасы къулланылды (STEMCELL Technologies). CD8 + Т-уджерелери CD8 MicroBeads (Miltenyi) ярдымынен ПБМК-дан айырылды ве истисалджынынъ косьтергичи боюнджа 2 афта девамында TransAct (Miltenyi) ярдымынен толу муитте кенишлетильди. Уджейрелерни 5 кунь девамында ИЛ-7 (10 нг/мл; PeproTech) олгъан толу муитте турмагъа къойдылар, сонъра TransAct иле янъыдан стимуляция эттилер. 7-нджи куню истисалджынынъ косьтергичи боюнджа, учь тур арды-сыра улькелерни зенгинлештирмек ичюн инсан CD45 MicroBeads (Miltenyi) къулланылды. Акъынты цитометриясы анализи ичюн улькелер аликвотагъа айырылды (юкъарыда тасвирленгени киби), LC-MS/MS анализи ичюн исе бир миллион ульке учь кере аликвотагъа айырылды. Нумюнелер ашагъыда тасвирленгени киби, ЖК-МС/МС ярдымынен ишленди. Биз етишмеген метаболитнинъ къыйметини 1000 ион сайысынен къыймет кестик. Эр бир нумюне умумий ион сайысы (УИС) иле нормаллештириле, логарифмик шекильде чевириле ве талильден эвель MetaboAnalystR программасында автоматик оларакъ нормаллештириле.
Эр бир хастанынъ бир улькели суспензиясы иритильди ве 40 мкм фильтрден кечирильди ве толу ортагъа сюзюльди (юкъарыда тасвирленгени киби). Истесалджынынъ протоколына коре, CD8+, CD4+ ве CD45- улькелери ичюн нумюнелерни зенгинлештирмек ичюн (буз устюнде) MicroBeads (Miltenyi) къулланып магнит боюнджакъ айырув ёлунен мусбет сечимнинъ учь туры арды-сыра къулланылды. Къыскъадан айткъанда, улькелерни ульке зенгинлештирюв буферинде (юкъарыда тариф этильгени киби) гъайрыдан суспензия этелер ве сайалар. Уджейрелерни инсан CD8 боюнджакълары, инсан CD4 боюнджакълары я да инсан CD45 боюнджакълары (Мильтенйи) иле 4°С температурада 15 дакъкъа девамында инкубация этелер, сонъра джесетлерни зенгинлештирюв буфери иле ювалар. Орнек ЛС колонкасында (Мильтенйи) кечириле, мусбет ве менфий кесирлер топлана. Муддетни эксильтмек ве улькенинъ тюзелюв адымыны энъ юксек севиеге чыкъармакъ ичюн, сонъра CD8-фракциясы CD4+ зенгинлештирювининъ экинджи туры ичюн, CD4-фракциясы исе сонъраки CD45-зенгинлештирювинде къулланыла. Айырув джерьянында эритмени буз устюнде тутынъыз.
Метаболитлернинъ анализи ичюн нумюнелерни азырламакъ ичюн улькелерни буз киби сувукъ туз иляджынен бир кере ювдылар, эр бир нумюнеге 1 мл 80%-ли метанол къоштылар, сонъра бурюшиклерни айландырдылар ве сувлу азотта бузлаттылар. Нумюнелер учь кере бузлатув-иритюв девирлерине кечирильди ве 4°С температурада 15 дакъкъа девамында 14 000 айланув/дакъкъада центрифугагъа къоюлды. Метаболитлер олгъан супернатанты къуругъандже бувлана. Метаболитлерни 50 мкл 0,03%-ли мурджие экшилигинде янъыдан ириттилер, къарыштырмакъ ичюн бурюштирдилер, сонъра къалдыкъларны чыкъармакъ ичюн центрифугагъа къойдылар.
Юкъарыда тасвирленгени киби, метаболитлерни чыкъарынъыз. Супернатантны метаболомика тедкъикъатлары ичюн юксек перформанслы сувлу хроматография шишесине авуштырынъыз. Партия тесирининъ огюне кечмек ичюн эр бир нумюнени якъын сайыда улькелернен ишлемек ичюн тасадифий тедавийлев протоколыны къулланынъыз. Биз эвель AB SCIEX QTRAP 5500 учь квадрупольли масса спектрометринде (50) дердж этильген глобаль метаболитлернинъ кейфиетли къыйметини кестик. Хроматографик талиль ве пик мейданынынъ интеграциясы MultiQuant 2.1 версиясы программасы (Applied Biosystems SCIEX) ярдымынен япылды.
Эксик метаболитнинъ къыйметини къыймет кесмек ичюн 1000 ион сайысы къулланылды, эр бир нумюненинъ ТИК-и эр бир тапылгъан метаболитнинъ нормаллештирильген пик мейданыны эсапламакъ ичюн къулланылды, нумюненинъ ишленмесинден инструменталь анализ кирсеткен денъишмелерни тюзетмек ичюн. ТИК нормаллештирильген сонъ, логарифмик чевирюв ве автоматик норма сызыгъы масштаблаштырув ичюн MetaboAnalystR(51) (стандарт параметр) къулланыла. Биз нумюне чешитлери арасында метаболом фаркъларынынъ араштырма талилини япмакъ ичюн веган R пакетли ПКА къулландыкъ, хасталарны талиль этмек ичюн исе къысмен артыкъчалыкъ талилини къулландыкъ. Уорд усулыны къулланып, нумюнелер арасындаки Евклидий месафенинъ кластерлештирильмеси ичюн иссилик харитасы дендрограммасыны къурынъыз. Биз бутюн ульке типи ве микромуит боюнджа дифференциаль бол метаболитлерни бельгилемек ичюн стандартлаштырылгъан метаболитлернинъ чокълугъы узеринде лимма (52) къулландыкъ. Анълатманы саделештирмек ичюн, биз моделни косьтермек ичюн группа орталама параметрини къулланамыз, ве микромуиттеки ульке тюрлерини эр бир группа оларакъ бакъып чыкъамыз (n = 6 группа); эмиетлик тести ичюн эр бир метаболит ичюн учь кере текрарлангъан ольчю яптыкъ Ялан репликациядан къачынмакъ ичюн хаста лимма лейхасына маниа оларакъ кирсетильди. Чешит хасталар арасында метаболитлернинъ фаркъларыны тешкермек ичюн биз хасталарны да къошып лимма моделини тургъун шекильде уйгъунлаштырдыкъ. Биз Padj <0,05 (Бенджамини-Хохберг тюзетмеси) ульке типи ве микромуити арасында эвельден бельгиленген контрастнынъ эмиетини хабер этемиз.
Miltenyi Dead Cell Removal Kit (>80% омюрге къабилиет) ярдымынен вигор зенгинлештирювден сонъ, 10х 5′ген экспрессия протоколы ярдымынен умумий джанлы бузлагъан асцит ве шишик нумюнелери узеринде бир улькели транскриптома секвенсированиеси япылды. Бир шишик нумюнесинден алчакъ яшайыш къабилиети оны кирсетмеге маниа олса да, уйгъунлашкъан шишиклер ве асцит олгъан беш ал талиль этильди. Хасталарнынъ чокътан-чокъ сечимине иришмек ичюн эр бир хастанынъ нумюнелерини 10х хром контроллерининъ ёлакъларында бирлештирдик, асцит ве шишик ерлерини айрыджа талиль эттик. Сыралаштырувдан сонъ [Illumina HiSeq 4000 28×98 н.п.чифт уджу (ПЭ), Квебек геномы; шишик ве асцит ичюн эр бир улькеде орта эсапнен 73 488 ве 41 378 окъув]], биз CellSNP ве Vireo (53) къулландыкъ (CellSNP эсасында бойле GRCh38 тарафындан берильген умумий инсан SNP (VCF) генотипке донор кимлиги бериле. (ИБС), тайинленмеген улькелерни ве асцит ве шишик нумюнелери арасындаки келишкен донорлар оларакъ белли этильген улькелерни эсапкъа алмагъан алда (54) биз ашагъы акъынты анализи ичюн шишик ве асцитте улькенинъ бол тасвири олгъан учь алны сакълап къалдыкъ (BiCoran фильтрация адымы бу5) 6975 ульке (шишик ве асциттен 2792 ве 4183 ульке) талиль ичюн берди Биз igraph's (57) Лувен ген кластерлештирювини къулланамыз, о, Джаккарднынъ кластер типли улькелерге месафесине эсасланып, экспрессия ярдымынен эльнен ерлештирильди. ве t-SNE иле корьгезильген Цитотоксик Т-уджерелери CD8A ве GZMA экспрессиясы иле бельгилене, биз Izar ве башкъаларнынъ (16) дердж этильген малюматларына ириштик, шу джумледен оларнынъ t-SNE экспрессиясы арасындаки экспрессияны идаре эте биле.
ПБМК лейкоцитлерни айырув махсулатларындан (STEMCELL Technologies) Фиколл градиент сыкълыгъы центрифугалав ёлунен айырылды. CD3 + улькелери ПБМК-дан CD3 боюнджакълары (Мильтенйи) ярдымынен айырылды. МНК олгъанда я да олмагъанда CD3+ улькелери пластинкагъа багълы CD3 (5 мкг/мл), ириген CD28 (3 мкг/мл) ве IL-2 (300 Е/мл; Пролейкин) иле активлештирильди. Кенълештирювнинъ сонъки кунюнде акъынты цитометриясы ярдымынен омюрге къабилиет (Фиксабельная жизнеспособность краситель eFluor450, eBioscience) ве пролиферация (123count eBeads, Thermo Fisher Scientific) къыймет кесильди. Эффектор функциясыны 4 саат девамында GolgiStop ярдымынен ПМА (20 нг/мл) ве иономицин (1 мкг/мл) иле стимуляция этип къыймет кесинъиз ве CD8-PerCP (RPA-T8, BioLegend), CD4-AF700 (RPA-T4) , BioLegend) ве TNFFIorethioαTCana ни мониторинг этинъиз. (МАб11, БД) ола. кПЦР ве ЧИП улькелерини 4 саат девамында ПМА (20 нг/мл) ве иономицин (1 мкг/мл) иле стимуляция этинъиз. ИФА супернатанты 4 саат девамында ПМА (20 нг/мл) ве иономицин (1 мкг/мл) иле стимуляциядан эвель ве сонъ топланды.
RNeasy Plus Mini Kit (QIAGEN) ярдымынен РНК айырмакъ ичюн истисалджынынъ протоколына риает этинъиз. Орнекни бир тюрлю япмакъ ичюн QIAshredder (QIAGEN) къулланынъыз. Комплементар ДНК (кДНК) синтез этмек ичюн юксек имкянлы РНК-дан кДНК-гъа комплект (Thermo Fisher Scientific) къулланынъыз. Ген экспрессиясыны (истисалджынынъ протоколына коре) бойле зондларнен микъдарджа эсапламакъ ичюн TaqMan Rapid Advanced Master Mix (Thermo Fisher Scientific) программасыны къулланынъыз: Hs00196287_m1 (NNMT), Hs00154079_m1 (AOX1), Hs0042M27. Hs02786624_g1 [Гидрогенден чыкъкъан глицеральдегид-3-фосфат (ГАПДГ)] ве Hs01010726_м1 (СЛК22А2). Нумюнелер StepOnePlus акъикъий вакъыттаки ПЦР системасында (Applied Biosystems) (Applied Biosystems) MicroAmp тез оптик 96 лункалы реакция пластинкасында (Applied Biosystems) MicroAmp оптик пленкасынен чалыштырылды. 35-тен зияде олгъан эр бир Ct къыймети тапылув босагъасындан юксек сайыла ве тапылмаз деп бельгилене.
ЧИПни эвельден айтылгъаны киби япынъыз (58). Къыскъадан айткъанда, улькелерни формальдегиднен (сонъки концентрация 1,42%) ишледилер ве ода араретинде 10 дакъкъа девамында инкубация эттилер. Буз устюнде 10 дакъкъа девамында къошма шишюв буферини (25 мМ Hepes, 1,5 мМ MgCl2, 10 мМ KCl ве 0,1% NP-40) къулланынъыз, сонъра иммунопреципитация буферинде тасвирленгени киби гъайрыдан суспензия этинъиз (58 ). Сонъра нумюне бойле девирлернен ультрасеснен чалыштырылды: 10 девир (20 1 саниедеки импульс) ве 40 саниеде статик вакъыт. ЧИП сыныфлы иммуноглобулин G (Уджейре сигнал берюв технологиясы; 1 мкл), гистон Н3 (Уджейре сигнал берюв технологиясы; 3 мкл), NFAT (Invitrogen; 3 мкл) ве SP1 (Уджейре сигнал берюв технологиясы; 3 мкл) антителоларыны нумюненинъ sha°4° CCn агъырлыгъында инкубация этинъиз. А акъсилининъ боюнджакъларыны (Thermo Fisher Scientific) 4°С температурада 1 саат девамында йымшакъ чайкъап, нумюненен инкубация этинъиз, сонъра ДНК-ны зенгинлештирмек ичюн челекс боюнджакъларыны (Bio-Rad) къулланынъыз, акъсиллернинъ азырланмасы ичюн исе К протеиназасыны (Thermo Fisher) къулланынъыз. ТНФα промоторы ПЦР ярдымынен тапылды: огге, ГГГ ТАТ ССТ ТГА ТГС ТТГ ТГТ; аксине, ГТГ ССА АСА АКТ ГСС ТТТ АТА ТГ (207 н.п.-лик махсулат). Ресимлерни Image Lab (Bio-Rad) ширкети чыкъарды ве ImageJ программасы ярдымынен микъдарджа эсаплады.
Уджейре культурасы супернатанты юкъарыда тасвирленгени киби топланды. Тайинлев истисалджынынъ инсан ТНФα ИФА комплекти (Invitrogen), инсан ИЛ-2 ИФА комплекти (Invitrogen) ве инсан ИФН-γ ИФА комплекти (Abcam) процедураларына коре япылды. Истесалджынынъ протоколына коре, супернатантны ТНФα ве ИЛ-2 тапмакъ ичюн 1:100, ИФН-γ тапмакъ ичюн исе 1:3 ольчюде иритильди. 450 нм-де абсорбцияны ольчемек ичюн EnVision 2104 чокъ ярлыкълы окъуйыджы (PerkinElmer) къулланынъыз.
ПБМК лейкоцитлерни айырув махсулатларындан (STEMCELL Technologies) Фиколл градиент сыкълыгъы центрифугалав ёлунен айырылды. CD3 + улькелери ПБМК-дан CD3 боюнджакълары (Мильтенйи) ярдымынен айырылды. МНК олгъанда я да олмагъанда CD3+ улькелери 3 кунь девамында пластинкаларгъа багълы CD3 (5 мкг/мл), ириген CD28 (3 мкг/мл) ве IL-2 (300 Е/мл; Пролейкин) иле активлештирильди. куньден сонъ улькелерни топлап, 0,9%-ли физиологик ернен ювдылар, пеллетни исе бузлаттылар. Уджейрелернинъ сайысы 123count eBeads къулланып, акъынты цитометриясы (Cytek Aurora; 3L-16V-14B-8R конфигурациясы) ёлунен япылды.
Юкъарыда тасвирленгени киби, метаболитлерни чыкъарынъыз. Къурутылгъан экстракт 4000 ульке эквиваленти/мкл концентрацияда ерлештирильди. Орнекни терс фазалы хроматография (1290 Infinity II, Agilent Technologies, Santa Clara, CA) ве CORTECS T3 колонкасы (2,1×150 мм, парчачыкъларнынъ колеми 1,6-мкм, тешиклернинъ колеми 120-Å; #186008500) ярдымынен талиль этинъиз. Электропульверизатор ионизациясы мусбет режимде чалышкъан поляр масса спектрометри (6470, Agilent). А кочьме фазасы 0,1% мурджие экшилиги (Н2О ичинде), В кочьме фазасы 90% атсетонитрил, 0,1% мурджие экшилигидир. ЖК градиенти 100% А ичюн 0 — 2 дакъкъа, 99% В ичюн 2 — 7,1 дакъкъа, 99% В ичюн 7,1 — 8 дакъкъа.Сонъра 3 дакъкъа девамында 0,6 мл/дакъкъа акъынты тезлигинен А кочьме фазасы олгъан колонканы янъыдан мувазенеге кетиринъиз. . Акъынты 0,4 мл/дакъкъа, колонна камерасыны исе 50°С температурагъадже къыздыралар. МНА-нынъ темиз химиявий стандартыны (М320995, Toronto Research Chemical Company, North York, Ontario, Canada) къулланып, тутув вакътыны (РТ) ве трансформацияны (РТ = 0,882 дакъкъа, трансформация 1 = 137→94,1, трансформация 2 = 137, конверсия→373) бельгиленъиз. Эр учь кечюв де догъру тутув вакътында олып кечкенде, спецификликни темин этмек ичюн, микъдарны эсаплав ичюн 1-нджи кечюв къулланыла. МНК (Toronto Research Chemical Company) стандарт эгриси 0,1, 1,0, 10 ве 100 нг/мл ве 1,0 ве 10 мкг/мл сувлулыкъ стандартларыны эльде этмек ичюн махсулат иляджынынъ (1 мг/мл) алты сериялы иритильмеси иле мейдангъа кетирильди. Ачыкъланув сынъыры 1 нг/мл, сызыкълы джевап исе 10 нг/мл ве 10 мкг/мл арасындадыр. Эки микролитр нумюне ве стандартнынъ эр бир инъекциясы ЖК/МС анализи ичюн къулланыла, анализ платформасынынъ тургъунлыгъыны темин этмек ичюн эр секиз инъекцияда къарышыкъ кейфиет тешкерюв нумюнеси чалыштырыла. МНК иле ишленген бутюн ульке нумюнелерининъ МНК джеваплары анализнинъ сызыкълы диапазонында эди. Малюматларнынъ талили MassHunter микъдар талиль программасы (v9.0, Agilent) ярдымынен япылды.
Экинджи несиль αFR-CAR конструкциясы Song ве башкъаларындан алынды. (59) ола. Къыскъадан айткъанда, конструкцияда бойле мундеридже бар: CD8a лидер сырасы, инсан αFR-ге хас бир зынджырлы денъишкен фрагмент, CD8a шарнир ве трансмембраналы регион, CD27 ич ульке домени ве CD3z ич ульке домени. Толу CAR сырасы GenScript ярдымынен синтез этильди, сонъра трансдукциянынъ эффективлигини къыймет кесмек ичюн къулланылгъан GFP экспрессия кассетасындан юкъарыдаки экинджи несил лентивирус экспрессия векторына клонланды.
Лентивирус HEK293T улькелерини трансфекция этмек ёлунен мейдангъа кетириле [Америка тип культурасы топламы (ATCC); 10% дёгме сыгъыр къан плазма (FBS) ве 1% PenStrep олгъан Дульбекконынъ модификациялангъан Eagle муитинде осьтюрильген ве CAR-GFP векторы къулланылгъан ве Къаплама плазмидлери (psPAX2 ве pMD2.G, Addgene) липофекция аминини (Sigma-Aldrich) къуллангъан. Вирус олгъан супернатанты трансфекциядан 48 ве 72 саат сонъ топланды, сюзюльди ве ультрацентрифуга ёлунен концентрацияланды. Концентрациялангъан вирус супернатантыны трансдукциягъа къадар -80°С температурада сакъламакъ керек.
ПБМК сагълам донор лейкоцитлерини айырув махсулатларындан (STEMCELL Technologies) Ficoll градиент сыкълыгъы центрифугалав ёлунен айырыла. ПБМК-дан CD8+ улькелерини айырмакъ ичюн мусбет сечимли CD8 микробончиклерини (Мильтенйи) къулланынъыз. Т-уджерелерни ТрансАкт (Мильтеньи) ярдымынен ве ТексМАКС муитинде [Мильтеньи; 3% сыджакътан инактивациялангъан инсан къан плазмасына, 1% ПенСтреп ве ИЛ-2 (300 Е/мл) иле толдурылгъан]. Стимулациядан сонъ йигирми дёрт саат кечкен сонъ Т-уджерелери лентивируснен трансдукция этильди (106 улькеге 10 мкл концентрациялангъан вирус супернатанты). Cytek Aurora (FSC (Forward Scatter)/SSC (Side Scatter), Singlet, GFP+ устюнде трансдукциядан сонъ 1-3 кунь кечкен сонъ, трансдукциянынъ энъ азындан 30% эффективлигини косьтермек ичюн улькелернинъ GFP экспрессиясыны къыймет кесинъиз .
CAR-T улькелери 24 саат девамында Immunocult (STEMCELL Technologies; 1% PenStrep иле толдурылгъан) махсулатында бойле шараитлерде осьтюрильди: ишленмеген, 250 мкМ аденозин я да 10 мМ МНК иле ишленген. Эвельден ишленген сонъ, CAR-T улькелери PBS иле ювулды ве 20 000 SK-OV-3 улькелеринен бирлештирильди [ATCC; 10% FBS ве 1% PenStrep иле толдурылгъан McCoy 5A муитинде (Sigma-Aldrich) 10: 1 эффекторнынъ макъсадкъа нисбети толдурылгъан Immunocult муитинде учь нусхада къуветлештирильди. Менфий ве мусбет контроль оларакъ digitalis сапониннен (0,5 мг/мл; Sigma-Aldrich) лиз этильген SK-OV-3 улькелери ве SK-OV-3 улькелери къулланылды. саат девамында бирликте осьтюрильген сонъ, супернатанты топланды ве истисалджынынъ косьтергичи боюнджа лактатдегидрогеназа (ЛДГ) ольченильди (LDH Glo Cytotoxicity Assay Kit, Promega). ЛДГ супернатанты ЛДГ буферинде 1:50 ольчюде иритильди. ольдюрювнинъ фаизи бойле формула ярдымынен ольченильди: ольдюрювнинъ фаизи = тюзетювнинъ фаизи / ольдюрювнинъ максималь косьтергичи х 100%, мында тюзетювнинъ фаизи = тек кокультура-Т-уджерелери, ве энъ буюк ольдюрювнинъ фаизи = мусбет контроль-менфий контроль.
Метинде я да материалларда ве усулларда тасвирленгени киби, статистик талиль ичюн GraphPad Prism 8, Microsoft Excel я да R v3.6.0 программаларындан файдаланынъыз. Эгер бир хастадан бир къач нумюне топланса (асцит ве шишик киби), биз чифт t тестини къулланамыз я да хастаны уйгъун олгъанда сызыкълы я да умумийлештирильген моделге тасадифий эффект оларакъ кирсетемиз. Метаболомика талили ичюн эмиет тести учь нусхада япыла.
Бу макъаленинъ къошма материалларыны http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/4/eabe1174/DC1 адресинден алмакъ мумкюн.
Бу Creative Commons Attribution-Non-Commercial License шартларына коре даркъалгъан ачыкъ иришильген макъаледир, о, эр бир муитте къулланмагъа, даркъатмагъа ве чокълаштырмагъа имкян бере, тек сонъки къулланув тиджарет къазанчы ичюн олмаса ве премема асыл эсернинъ догъру олгъаны олса. Атыф.
Ишарет: Биз тек сизден почта адресинъизни бермеге риджа этемиз, сиз саифеге тевсие этеджек адам сиз почтаны корьмеге истегенинъизни ве бу спам олмагъаныны бильсин. Биз ич бир почта адресини запт этмейджемиз.
Бу суаль сизнинъ мусафир олгъанынъызны тешкермек ве автоматик спам ёлланмасынынъ огюне кечмек ичюн къулланыла.
Мариса К. Килгур (Мариса К. Килгур), Сара Макферсон (Сара Макферсон), Лорен Г. Захария (Лорен Г. Захария), Эбигейл Эли Арис Г. Уотсон (Х. Уотсон), Джон Стагг (Джон Стагг), Бред Х. Расселс), Бред Х. Джонс Нельсон (Брэд Х. Нельсон), Ральф Дж. Р. Де Белл ( Бред Х. Нельсон), Ральф Дж. Р. Де Белл (Рассел Дж. Джонс), Финеас Т. Гамильтон (Финеас Т.
МНК Т-уджерелернинъ иммунитет бастырылмасына ярдым эте ве инсан рак хасталыгъыны тедавийлемек ичюн потенциаль иммунотерапия нишаныны тешкиль эте.
Мариса К. Килгур (Мариса К. Килгур), Сара Макферсон (Сара Макферсон), Лорен Г. Захария (Лорен Г. Захария), Эбигейл Эли Арис Г. Уотсон (Х. Уотсон), Джон Стагг (Джон Стагг), Бред Х. Расселс), Бред Х. Джонс Нельсон (Брэд Х. Нельсон), Ральф Дж. Р. Де Белл ( Бред Х. Нельсон), Ральф Дж. Р. Де Белл (Рассел Дж. Джонс), Финеас Т. Гамильтон (Финеас Т.
МНК Т-уджерелернинъ иммунитет бастырылмасына ярдым эте ве инсан рак хасталыгъыны тедавийлемек ичюн потенциаль иммунотерапия нишаныны тешкиль эте.
©2021 Илимнинъ илерилеви ичюн Америка бирлешмеси. бутюн акълар сакълангъан. АААС - ХИНАРИ, АГОРА, ОАРЕ, ХОР, КЛОКСС, КроссРеф ве САЙЧЫКЪнынъ шериклеридир. Илимнинъ илерилеви ISSN 2375-2548.