Nature.com сайтына кельгенинъиз ичюн сагъ олунъ.Сиз къуллангъан браузернинъ версиясында CSS сынъырлы дестек бар.Энъ яхшы теджрибе ичюн биз сизге янъылангъан браузерни къулланмакъны тевсие этемиз (я да Internet Explorer-де уйгъунлыкъ режимини сёндюрмек).Бу арада, девамлы дестекни темин этмек ичюн, биз сайтны стильлерсиз ве JavaScriptсиз косьтерирмиз.
Омургъалы айванлардан фаркълы оларакъ, боджеклерде эркеклерге тарафдар джынсий стероид гормонлары ёкъ, деп кениш фикирлер бар.Anopheles gambiae махлюкъында экдизон стероиди 20-гидроксиэкдизон (20Е) дишилер тарафындан синтез этильгенде йымырта инкишафыны идаре этмек ичюн эволюциягъа кечкен, эркеклер тарафындан гъайрыдан джынсий период3 ёлунен3 индюкация этмек ичюн эволюциягъа кечкен. йымырта инкишафы ве чыкъыш зарур репродуктив чизгилердир, диши Anopheles чибинлери бу гормональ сигналларны насыл этип интеграция этелер, буны анъламакъ янъы маляриягъа къаршы куреш программаларыны уйдурмагъа ярдым эте биле.Мында биз бу репродуктив функциялар айры джынсий стероидлер тарафындан экдистероидлерни идентификациялагъан мафиактив ферментлернинъ муреккеп агъы вастасынен идаре этильгенини ачыкълаймыз. оксидленген экдизон, 3-дегидро-20Е (3D20E), о, ана-бабалыкъны къорчалай, джынсий кочювден сонъ къадын джынсий къабул этювини къапатып, дефосфорилляция ёлунен активлештириле. дишилер.Дишилерден алынгъан 20Е джынсий джевапны догъурмай, амма 20Е-ни ингибирлеген киназалар ингибирленген сонъ чыкъкъан айры инсанларгъа йымырта къоймагъа имкян бере.Бу эркекке хас олгъан боджек стероид гормонынынъ айдынлатмасы ве онынъ дишилернинъ фертилитетини низамлавдаки ролю интерсексуаль редукция ве P безгек хасталыгъыны ёллагъан чибинлернинъ несиль осьтюрюв мувафакъиети.
Инсан безгек паразитлерининъ екяне векторы олгъан Anopheles чибинлеринде инсектицидлерге къаршы турувнынъ кениш даркъалгъаны себебинден безгек хасталыгъына огърагъанлар ве олюмлер кене де арта4.Бу чибинлернинъ чыкъыш биологиясы безгекке къаршы янъы къарышмалар ичюн айрыджа меракълы нишандыр, чюнки дишилер тек бир кере чыкъыш этелер5; бу бир керелик чыкъыш вакъиасыны стериль япмакъ тарлада чибинлернинъ популяциясыны эксильтмек ичюн буюк имкянгъа малик олур эди.
Къадынлар эркеклерден юксек титрли стероид гормонларыны алгъан сонъ джынсий джеэттен къабилиетсиз ола.Тедкъикъатлар илеридеки чыкъышта къыйынлыкъларнынъ себеби 20-гидроксиэкдизон (20Е) олгъаныны косьтере, бу стероид гормон личинка дереджесинде личинка девирининъ регуляторы оларакъ даа яхшы беллидир. Африкада даркъалгъан ве безгекнинъ энъ хавфлы ташыйыджыларыны, шу джумледен Anopheles gambiaeни де къаврап алгъан Cellia7 алт союнынъ бир къысмы олгъан Anopheles тюрлери.Бу хусусан дикъкъаткъа ляйыкътыр, чюнки бу тюрлерде дишилер де эр бир къан ашындан сонъ 20Е чыкъаралар, 20E исе лихогенезнинъ ёлуны айдамакъта, оогенез акъкъында билемиз8). анда дишилер озь чыкъыш къабилиетини бозмайып, экдизоннынъ эки чешит менбасындан (эркеклерни кочюрмек ве къаннен гъыдаланувны индукция этмек) сигналларны интеграция этелер.Аслинде, эгер дишилер чыкъаргъан 20Е джынсий даянылмазлыкъны къозгъаса, бу, бакире гъыдалангъан айванларда бессизликке кетиреджек, бу пек кенъ даркъалгъан арекетлерде5.
Мумкюн олгъан анълатма шунда ки, A. gambiae эркеклери эркекке хас олгъан модификациялангъан экдизонны кечирелер, бу исе къадын несиль ёлларында сигнал каскадыны фаальлештире, бу исе чыкъышта тургъунлыкъсызлыкъкъа кетире.Лякин омузлы айванларда эстроген ве андроген киби бир чокъ стероид гормонлары олса да, todgef. боджеклерде стероидлер тапылмагъан.
Биз джынсий джеэттен пишкин олгъан A. gambiae махлюкъатынынъ эркек эркек аксессуар безинде (МАГ) стероид гормонларынынъ репертуарыны бельгилемеге ёлгъа чыкътыкъ, мумкюн олгъан модификация стероидлерини къыдырмакъ ичюн. бу токъумада, эвельки нетиджени тасдыкълай.Лякин нумюнеде 3-дегидро-20Е-22-фосфат (3Д20Е22Р)12 формуласына келише, оксидленген фосфорлангъан стероидлер укюм сюре эди (1 рес.).Дигер шекиллерге 3-дегидро-20Е)20Е (20Е)3 кире. (20Е22Р).3Д20Е22Рнинъ ВЭЖХ-МС/МС сигналынынъ интенсивлиги онынъ дефосфорлангъан шекилинден, 3Д20Е-ден эки тертипте, Е ве 20Е-ден учь тертипте зияде олса да (1 рес.).Беденнинъ башкъа къысымларында олса да, репродуктив рес.Рт. 1а).Биз де янъы къапатылгъан (<1 куньлюк) эркек ве диши айванларда экдистероидлерни талиль эттик ве тек МАГ-да 3D20E ве 3D20E22P таптыкъ; Е, 20Е ве 20Е22Р эр эки джынста да бар эди (Кенишлетильген малюмат 1б рес.).Бу малюматлар A. gambiae уйкен эркеклери озь МАГларында дишилер тарафындан синтез этильмеген модификатор гормонларнынъ юксек титрлерини чыкъаргъанларыны косьтере.
куньлюк (4 куньлюк) бакире эркеклерден ве бакире ве чыкъкъан дишилерден (0,5, 3, ве 12 л.с.) МАГ ве ​​къадын ЛРТ (онынъ ичинде атриум, урлукъ пузырьлери ве паровариум) дискретлештирильди.Бу токъумалардаки экдизон falmered ±sempaise, t кешфият косьтергичи (ФДР) тюзетильди; *Р < 0,05, **Р < 0,01 .3Д20Е: 3 саат къаршы 0,035; 12 саат къаршы 0,002 саат . 3Д20Е22Р: 3 саат къаршы 0,5 саат, Р = 0,25; 12 саат къаршы 3 саат, Р = 0,0032; 12 саат къаршы 0,5 саат, Р = 0,015). чибинлер.Экдизон ренкнен бойле косьтериле: Е, ешиль; 20Е, порткъалы; 20Е22П, мор тюсте; 3Д20Е, кок тюсте; 3D20E22P, гульдестени.Къошма экдизоннынъ ашагъы севиелерини косьтермек ичюн у-кошесинде шкаланы арттыра.
3D20E22P ве 3D20E чыкъыш вакътында кочип кечкенини тешкермек ичюн, биз чыкъыштан сонъ чешит вакъыт нокъталарында къадын ЛРТ-лерни дискретлештирдик.Экдизон къызларда тапылмаса да, биз ЛРТ-де 3D20E22Pнинъ муим микъдарда олгъаныны козьде туттыкъ), h5p-ден сонъ деръал h5p-ден сонъ, h5p.a. вакъыт кечтикче, 3Д20Е севиелери исе эп арта (1 рес.).Химик синтез этильген 3Д20Е стандарт оларакъ къулланып, биз чыкъыш ЛРТлерде бу стероид гормоннынъ севиелери 20Е-ден энъ аздан 100 кере зияде олгъаныны бельгиледик (Кенишлетильген малюматлар джедвели 1).Бойлеликнен, maP20one transfer2 theE is чыкъыш вакътында къадын ЛРТ чыкъара, онынъ дефосфорлангъан шекли 3D20E исе чыкъыштан сонъ чокъкъа бармай юксек дереджеде чокъ ола.Бу къадынларнынъ чыкъыштан сонъки биологиясында сонъки экдизоннынъ муим ролюни тасавур эте.
Янъы РНК секвенсированиеси (RNA-seq) малюмат топламыны (2а рес.) мейдангъа кетирген сонъ, махсус япылгъан биоинформатика бору ёлуны къулланып, биз экдизонкиназа (ЭсК), экдизон оксидаза (ЭО) ве 20Е-модификациялангъан фосфатаза намзетини кодлагъан экдизонны къыдырдыкъ. ЭПП гени ве эки потенциаль ЭсК гени (ЭсК1 ве ЭсК2), амма яхшы намзет ЭО генини тапып оламадылар.Къайд этмек керек ки, айры ЭПП генлери Гамбия МАГларында юксек севиеде (98,9-нджы процентиль) ифаделенди, амма къадын ЛРТлерде дегиль (2б рес.), бизим беклевлеримизге къаршы деДфо22 бу къадын токъумасы.Бунынъ ичюн биз эркек ЭПП чыкъыш вакътында кочип оладжагъына ишанамыз.Акъикъатен, биз чыкъыштан сонъ къадын акъыны маскаламакъ ичюн in vivo стабиль изотоп маркировкасыны къулландыкъ, бу фермент къадын атриумында МС тарафындан белли олды (2в рес. ве LRT да male ве 1-нджи къошма джедвелде эди). специфик антителолар къулланып тасдыкълангъан (2г рес.).
а, Эр бир джынснынъ несиль осьтюрюв токъумаларында ЭсК, ЭО ве ЭПП кодлагъан генлерни къыдырмакъ ичюн махсус къурулгъан биоинформатика бору ёлу.Окълар янындаки ракъамлар эр бир адымда эркек ве къадын намзетлернинъ сайысыны косьтере.Бу талильде бир ЭППЭ ген ве экспресс ген (ЭК1) белли олды. эркеклер, ве бир EcK гени (EcK2), о, эки джынста да ифаделенген, амма намзет ЭО генини бермей.б, Анофелес gambiae ве Anopheles albicans токъумаларында намзет геннинъ ифаделенювини бакире (V) ве чыкъыш (M) тенъештирген иссилик харитасы.Spca, дёгюльме; МАГлар, эркеклердеки ярдымджы безлер; беденнинъ башкъа къысымлары, шу джумледен кокюслер, къанатлар, аякълар, ягълы беденлер ве эки джынста да ички мучелер, къадынларда исе йымырталыкълар.ЭсК2 эм Гамбиянынъ МАГ-ында, эм де атриумларында юксек севиеде ифаделенген, ЭПП исе тек МАГ.с, Эркек эякуляциясынынъ протеомик талили ат2 ве3 ат4. hpm, энъ чокъ 67 акъсиллерни косьтере.Дишилер бутюн акъсиллерни бельгилемек (ве маскаламакъ) ичюн 15N олгъан рационда осьтюрильди.Биргиленмеген эркеклер бельгиленген дишилернен чифтлештирильди, диши ЛРТлер исе 3, 12 ве 24 л.с. бельгилери).Бу токъумаларнынъ протеомик анализи ярдымынен бакире эркеклернинъ МАГ-ында инсет, ЭПП, Эк1 ве ЭсК2 тапылды.г, ЭПП чыкъарылгъан дишилернинъ МАГ ве ​​ЛРТ-де вестерн-блот ярдымынен тапылды, амма бакире дишилерде я да эркеклерде я да къадын беденининъ къалгъан къысмында дегиль. анти-ЭПП антителолары.Эписи эркеклер бакиредир.Гель менбасы малюматлары ичюн 1-нджи къошма ресимге бакъынъыз.Вестерн-блот эки кере япылды ве нетиджелер бойле олды.
ЭППнинъ экдистероид фосфосфатаза фаалиети МАГ-дан айырылгъан 3D20E22P иле ВЭЖХ-МС/МС иле инкубациядан сонъ тасдыкъланды (Кенишлетильген малюмат 2а рес.).Бундан гъайры, биз ЭПП-ни РНК-вастасынен репродуктив интерференция (РНКи) ярдымынен ЭПП-ни сустыргъанда, биз бу тиссутанынъ 2000 сенеси кучьлю азайлувыны таптыкъ. (3а рес.), ве ЭПП-нен сустырылгъан эркеклернен чыкъкъан дишилер генлернинъ къысмен сустырылгъанына бакъмадан, дефосфорилленген 3D20Eнинъ эмиетли А алчакъ пайыны косьтере (3б рес.) (Кенишлетильген малюмат 2б,в рес.). ферментнинъ 3D20E22P ичюн специфик олгъаныны тасавур этелер (3, б рес.).
а, Эки зынджырлы ЭПП РНК (dsEPP) я да эки зынджырлы ГФП РНК (dsGFP) контрольлери къулланып, ЭППнинъ сустырылмасы себебинден МАГ-да фосфатаза фаалиетининъ эксильмеси.Эр бир репликада йигирми МАГ пулы къулланылды (Р = 0,0046, чифт долес, Feles by,d. ЭПП-сустырылгъан эркеклернен чифтлешкенлерде 3 л.с.-де дефосфорилленген 3Д20Енинъ пайыны эп эксильттилер (Р = 0,0043, чифтсиз t-тест, эки тарафлы), 20Е севиелери исе тесирленмеди (Р = 0,063, чифтсиз). t-тест, эки тарафлы).Малюматлар эр бири 13, 16 ве 19 дишиден ибарет учь пулдан орталама ± сем оларакъ берильген.в, ЭПП-сустырылгъан эркеклернен чыкъкъан дишилернинъ янъыдан чыкъыш косьтергичи эппейи юксек эди (Р = 0,0002, Фишернинъ догъру чыкъыш тести оларнынъ чыкъыш статусы энФ ичюн эки тарафлы эди). 2 куньден сонъ олар трансгеннинъ микъдарий ПЦР тапмасы ярдымынен янъыдан чыкъыш тезлигини къыймет кесмек ичюн трансген сперма ташыгъан башкъа эркеклернен багъландылар.г, ЭПП-нен сустырылгъан эркеклернен чыкъыш япкъан къаннен бесленген дишилерде догъув къабилиети эмиетли дереджеде эксильди (Р < 0,0001; Mann-Whitsidely reduced slight) тести, 0,088, Манн-Уитни тести, эки тарафлы) , йымырта къоюв тезлиги исе тесирленмеди (Р = 0,94, Фишернинъ догъру тести, эки тарафлы).Бутюн панельлерде n биологик джеэттен мустакъиль чибин нумюнелерининъ сайысыны косьтере.NS, эмиетли дегиль.*Р < **Р,0,1.05. ****Р < 0,001 ола.
Сонъра биз экдизон дефосфорилляциясы дишилерде чыкъыш къаршылыгъыны индюкация этмек ичюн муим олгъаныны къыймет кестик.Къайд этмек керек ки, ЭПП-ден эксильген эркеклернен чыкъыш япкъан дишилер, эмиетли (трансген) десерваза (рис. догъув къабилиети (3г рес., сол) ве бу дишилернинъ къойгъан йымырталарынынъ сайысы бираз эксильгени (3г рес., ортада), дишилернинъ йымырта къойгъан фаизине исе (дишилерде чыкъыш ёлунен чыкъарылгъан даа бир джевап )) тесир этмеди (3г рес., сагъ) EPP2 ичюн спецификликни козь огюне алгъанда. 3D20E нинъ чыкъыш вакътында кечирильген ЭПП тарафындан активлештирильмеси къадынларнынъ илеридеки чыкъышкъа къабул этювини сёндюрювде муим роль ойнай биледжегини теклиф этелер, бу арекет эвель 20E нинъ джынсий кечирильмесине багълы эди .Бунынъ ичюн эркекке хас олгъан бу гормон къадынларнынъ догъувына да кучьлю тесир эте.
Сонъра биз 20Е ве 3Д20Енинъ химиявий синтез этильген 3Д20Е (4а–в рес.) ве тиджаретте булунгъан 20Е къулланып, джынсий джеэттен пишкин къызларда япылгъан инъекция теджрибелеринде 20Е ве 3Д20Енинъ фаалиетини тенъештирдик. (4г рес.).Дикъкъаткъа ляйыкъ шей шунда ки, ЛРТ-де 3Д20Е физиологик севиесининъ ярысы (инъекциядан сонъ 1066 пг, чыкъыштан сонъ 2022 пг) 20Е инъекциядан сонъки физиологик севиесинден 20 кере зияде олгъан рефрактер дишилернинъ пайыны индюкация эте (хожекциядан сонъ203ин46) энъ юксек концентрация 18 пг чыкъыштан сонъ; Кенълештирильген малюматлар джедвели 1).Бу нетидже 20Енинъ джынсий ёлланмасы чыкъышкъа къаршы тургъан девирлерге себеп олмагъан фикирге келише ве даа зияде 3Д20Е ана-баба ве бала мунасебетини теминлемек ичюн эсас фактор оларакъ косьтериле.3Д20Е де 20Е-ден эппейи фааль эди йымырта-саймада 4 . биз къысмен ЭПП сустырувындан сонъ козьде туткъан нормаль йымырта къоюв тезлиги, 3D20E къалдыкъ фаалиетининъ олмасынен багълы эди, бу фаалиет даа чыкъарылгъан эди.
(а,б) 20Е-ден химиявий ёлнен синтез этильген 3Д20Е (а) пек юксек конверсия/эффективликке малик (учь мустакъиль синтез реакциясындан орталама ± сем оларакъ берильген малюмат) (б).в, Кутьле спектри (ашагъы ярысы) чыкъарылгъан къадын ЛРТ-де расткельген экдизонгъа там келише (юкъары ярысы μE =2g =2g,20,d). 0,02; 0,21 мкг, Р < 0,0001; Фишернинъ догъру тести, эки тарафлы) ве 10% этанол (0,63 мкг, Р < 0,0001; 0,21 мкг, тек контроль 2 тарафлы, зияде дозаларда (0,63 мкг, Р = 0,0002; 0,21 мкг, Р = 0,54; Фишернинъ догъру тести, 2 тарафлы).д, 3D20E инъекциясы 10% мкг, Р = 0.0 этанол контрольге коре бакире дишилерде йымырта къоювнынъ эппейи зияде ольчюсини индюкация этти; 0,13 мкг, Р = 0,0003;Фишернинъ догъру тести, эки тарафлы), 20Е исе контроль группагъа коре Тек зияде дозаларда (0,21 мкг, Р = 0,022; 0,13 мкг, Р = 0,0823; Фишернинъ эки тарафлы exa0ct зияде). 20Е-ден зияде дозаларда йымырта къоюв тезликлери (0,21 мкг, Р = 0,0019; 0,13 мкг, Р = 0,075; Фишернинъ догъру тести, эки тарафлы).Бутюн панельлерде n биологик джеэттен мустакъиль чибин нумюнелерининъ сайысыны косьтере,**РП, <0 дегиль.0.0. ***Р < 0,001, ****Р < 0,001.Малюмат учь текрарлавдан.
Эвельки араштырмаларда биз стероид гормонларнынъ джынсий ёлнен кечюви MISO (Mating-Induced Stimulator of Oogenesis 11) экспрессиясыны индюкация эте, бу A. gambiae дишилерини P. falciparum инфекциясындан къорчалай. 20Е инъекциясы махсус я да даа кучьлю шекильде базы ядро ​​гормон рецепторларыны (HR), меселя, HR3 ве HR4 киби, 3D20E я да 20E гормоны нишангъа алгъаныны бельгилемеге къарар бердик. Vg14, 15, 16, MISO 3D20E тарафындан даа кучьлю индукцияланды (Кенишлетильген малюмат 3 рес.).Бойлеликнен, бу андроген стероид гормонынынъ джынсий ёлланмасы, корюне ки, дишилерни паразит инфекциясы кетирген масрафлардан къорчалагъан механизмлерни индукция эте. Е рецепторы EcR, EcR-A индукциясы ве EcR-B репрессиясы, ве даа кучьлю дигер чыкъыш индукциясы генлерини, шу джумледен HPX15, къадынларнынъ догъувына тесир эте.Бу, EPP-silenced downstream males иле чыкъышта булунгъан дишилерде козьге чарпкъан эмиетли бессизликни анълата биле. джынскъа хас функциянынъ эсасында ола бильген эки экдизон гормоны тарафындан энъ яхшысы фаальлештириле.
Сонъра биз биоинформатика бору ёлунда белли олгъан эки EcK генининъ вазифесини сынадыкъ.EcK1 я да EcK2 нинъ сустырылмасы эркеклерде эмиетли олюмге кетире (Кенишлетильген малюмат 4а рес.), бу исе экдизоннынъ фосфорилляциясы, ве, демек, инактивациясы, сагъ къалмакъ ичюн муим олгъаныны косьтере.Чюнки EcK 2 севиесинде экспресс олды. протеомика ярдымынен МАГларда (2б,в рес. ве 2 къошма джедвел) онынъ экдистероид киназа фаалиетини 20Е иле инкубация этип тасдыкъладыкъ, бу исе 20Е22Р фосфорилляциясына кетире (кенишлетильген малюмат 2 рес.).4б). 3D20E22P (Кенишлетильген малюмат 4в рес.), бу исе 3D20E дегиль де, 20E EcK2нинъ энъ зияде нишанеси ола биледжегини косьтере.
Бизим РНК-секъ анализимизге коре, ЭсК2 де бакире дишилернинъ ЛРТ-синде юксек севиеде ифаделенген эди, анда о, чыкъыштан сонъ сёндюрильди (2б рес.).Биз бу малюматларны тасдыкъладыкъ ве ЭсК2 экспрессиясына къан ашатув тесир этмегенини бельгиледик (Кенишлетильген малюмат 5а рес.). 20Е22Р 20Енинъ тёпесинен якъындан багълы эди (къан ашындан сонъ 22-26 саат; Кенълештирильген малюмат 5б рес.).Бик дишилерде ЭсК2нинъ сустырылмасы 20Енинъ 20Е22Пнинъ нисбий нисбетининъ 3 кере артмасына кетире, 26 саатте 20Енинъ 20Е22Пнинъ нисбий нисбети 3 кере артты), малюматлар 26 саатте тасдыкълайлар. ЭсК2 де дишилерде 20Е фосфориллей.Къайд этмек керек ки, ЭсК2 эксильген къызлар джынсий къабул этмекни толусынен сакълап къалдылар (Кенишлетильген малюмат 5г,д рес.), бу исе къадынларнынъ 20Е чыкъарувы чыкъышкъа къаршы тургъан девирлерни индюкация этмегенини тасдикълай. 30%-ден зияде йымырта къойгъан къызчыкълар (Кенишлетильген малюмат 5е рес.).Эгер къаннен бесленген сонъ эки зынджырлы Eck2 РНК (dsEcK2) инъекциялары япылса, йымырта къоюв олмады, бу вакъытта къан ашамакъ себебинден 20Е тёпеси къан чыкъарувдан сонъ эксильген эди.Умумен, модель ки0 . йымырта къоюв, амма тек йымырта къоюв блогы (ЭсК2 ве, бельки де, башкъа факторлар) чыкъыш ёлунен сёндюрильгенде.Не 20Е, не де 3Д20Е инъекциялары къызларда ЭсК2 экспрессиясыны ингибирлемей эдилер (Кенишлетильген малюматлар 5г рес.), бу исе дигер факторлар бу феовер киназанынъ ингибиторлыгъына васталыкъ япкъаныны косьтере2. чыкъыш раатсызлыгъыны къозгъамакъ ичюн етерли эди, амма джынсий ёлнен кечирильген 3D20E юксек титрлери тарафындан эффектив шекильде къозгъалды.
Бизим нетиджелеримиз A. gambiae махлюкъатынынъ репродуктив мувафакъиетини низамлагъан механизмлер акъкъында муим малюмат бере.Бир модель пейда олды, анда эркеклер 3D20E юксек титрлерини синтез этмек ичюн эволюциягъа кечтилер, эркеклерге хас олгъан модификациялангъан экдизон, о, дишилерни илеридеки чыкъышкъа десенсибилизация этип, ана-бабалыкъны теминлей. эркеклерге хас ЭППнинъ джынсий кечювине джевап оларакъ дишилерде 3D20E-ни фаальлештирелер.Бизим бильгилеримизге коре, бу боджеклерде уникаль ве тенкъидий функцияны беджерген эркек ве къадын укюмдарлыкъ япкъан стероид гормон системасынынъ биринджи мисалидир.Эркеклерге хас экдизон функциясы кескин шекильде демонтажланды, амма буюк шекильде дисмонт этильди. 18-нджи гипотеза бойледир: бу вазифелерни 20Е прекурсоры Е1 беджере биле.Дрозофилаларда монандрия къадын несиль ёлларыны иннервациялагъан нейронларнен тесирлешкен кичик джынсий пептидлернинъ19,20 джынсий ёлнен кечювинен башлана, олар къадын несиль ёлларыны иннервациялагъан нейронларнен озьара тесир этелер. 3D20E иле идаре этильген каскадларны A. gambiae дишилеринде тапмакъ ве бу каскадларны чибинлер ве дрозофила арасында сакълап къалмакъ мумкюнми, бельгилемек ичюн.
Бизим араштырмамызда белли олгъан къадынларнынъ догъув ве давранышы узеринде 3D20Eнинъ муим ролюни козь огюне алгъанда, 3D20Eнинъ синтезине ве активлешмесине алып баргъан ёллар келеджекте чибинлерге къаршы куреш стратегиялары ичюн янъы имкянлар теклиф этелер, меселя, 2012 сенеси стериль боджеклер технологиясы стратегияларында ракъип стериль эркеклернинъ генерациясы. virgin play.3D20E эркеклерге хас олгъан функциясы A. gambiae ве дигер Cellia чешитлери озь спермасыны чыкъыш тыкъынтыларына къангъа бойсундырмакъ къабилиетини эльде эттилер, бельки де инкишаф этти, чюнки бу чокъ сайыда гормонлар ве гормонларны фаальлештирген ферментлерни семерели кечирмеге имкян бере.Озь невбетинде, 3D2 эволюцияны амельге кечирген ферма а. (MISO юксек экспрессиясы вастасынен) озь репродуктив уйгъунлыгъыны юксек малярия таркъалувы олгъан ерлерде зияде меракъландырмакъ ичюн, бу исе вастасыз оларакъ Plasmodium таркъалувына ярдым эте.20Е диши диши гормонларында P. falciparum сагъ къалувына ве осьмесине терен тесир эте, деп косьтерильгенини козь огюне алгъанда, Anopheles bomosquitoid mosquito2 ве4 энди чибинлернинъ паразитлернинъ озьара тесирининъ эсас тарафлары.
A. gambiae G3 штаммлары стандарт боджек шараитлеринде (26-28 °С, 65-80% нисбий дымлылыкъ, 12:12 с ярыкъ/къара фотопериод) осьтюрильди.Личинкалар тозлангъан балыкъ гъыдасынен беслендилер (TetraMin Tropical Flakes, Koi Ponduls of Tetra:7 in Tetra:7 in TetraMin Pellets and7). чибинлерни ад либитум 10% декстроза иляджы ве афталыкъ инсан къаны (къаннынъ компонентлерини огренмек) бердилер.Бик чибинлерни микроскопия ярдымынен уджларыны тешкерген сонъ, балачыкъ дереджесинде джынсларны айырып эльде эттилер.DsRed трансгенини ташыгъан эркеклер акъкъында эвельден айтылгъан эди.
Меджбурий чыкъыш теджрибелери эвельден тасвирленген протоколлар боюнджа япылды.Табиий чыкъыш ичюн 4 куньлюк бакире дишилерни джынсий джеэттен пишкин бакире эркеклернен 1:3 нисбетинде эки гедже туттылар.Эркеклерге дсЭПП инъекциясы япылгъан теджрибелер ичюн ко-къафесли фофаза3ин да-4 иле расткельди. максималь сустырылгъан (Кенишлетильген малюмат 2б рес.).
Сычанчыкъларнынъ токъумалары, къалгъан джесетлер (беденнинъ къалгъан къысмы), я да бутюн беден 100% метанолгъа дискретлештирильди ве монджукънен гомогенлештирильди (2 мм джам монджукълары, 2,400 айланув/дакъкъа, 90 с).Токъумаларнынъ микъдары ве метанолнынъ колемлери бойле олды: беденнинъ къалгъан къысмы,5 мк00. МАГ, 50–100 80 мкл; къадын ЛРТ, 25–50 80 мкл.Чёкюнди айны колемли метанолнен экинджи метанол экстракциясына огъратылды.Уджейре къалдыкълары центрифуга ёлунен чыкъарылды.Эки экстракциядан алынгъан метанолны бирлештирдилер ве азот акъымы алтында къуруттылар, сонъра ашагъыдаки 8 колемли метан ичинде гъайрыдан суспензия эттилер: 50 мкл олгъан; МАГ ве ​​къадын ЛРТ, 30 мкл.
Пробалар масса спектрометринде (ID-X, Thermo Fisher) талиль этильди, о, ЖК алетине (Vanquish, Thermo Fisher) къошулды.5 мкл проба 3 мкм, 100 × 4,6 мм колонкагъа инъекция этильди (Inspire C8, Dikma at2 ЖК фазалар5e main the A °C. (сув, 0,1% мурджие кислотасы) ве В (атсетонитрил, 0,1% мурдар кислотасы).ЛК градиенти бойле эди: 1 дакъкъа девамында 5% В, сонъра 11 дакъкъа ичинде 100% В-ге къадар арттырылды.100%-те 8 дакъкъадан сонъ В колонканы3 дакъкъагъа янъыдан мувазенеге кетиринъиз. мл мин-1.МС менбасында ионлаштырув мусбет ве менфий режимлерде къыздырылгъан электропуршивка ионизациясы ярдымынен эда этиле.
Кутьле спектрометри м/з диапазонында 350-ден 680-ге къадар малюматны 60 000 чешитликте толу МС режиминде ольчей.МС/МС малюматлары [М + Н]+ (бутюн нишанлар), [М - Н2О + Н]+ (бутюн нишанлар) ве [М - Н]- (нишанлы эксфорилленген нишанларнынъ эксфорилленген хусусиетлерини тасдыкълады). стандарт ёкъ эди.Макъсатсыз экдистероидлерни бельгилемек ичюн >15% нисбий боллукълы бутюн ВЭЖХ тёпелери ичюн МС/МС малюматлары талиль этильди.Саф стандартлардан (20Е, 3Д20Е) яратылгъан стандарт эгрилерни къулланып, тапылгъан мутлакъ микъдарларны эсапламакъ я да оларнынъ бир махсус нумюненинъ сийреклештирильмесини эсапламакъ ичюн микъдарны бельгиленъиз. эркек.3Д20Е ичюн микъдарны ашагъыдаки аддуктларнынъ джемиси ярдымынен япылды: [М + ТФА]-, [М + СООН]-, [М + Na]+, [М + Cl]-, [М + NO3]-.Малюматлар Tracefinder (версия 4.1) ярдымынен чыкъарылды ве микъдарджа эсапланды.МС/МСзед малюматлары uMSverli4 къулланылды). Е, 20Е ве 3Д20Е спектрлери уйгъун стандартларнен тенъештирильди.3Д20Е22Р Жирар реактиви иле дериватизация ёлунен талиль этильди.20Е22Р м/з нисбети иле талиль этильди.
3D20E22P МАГ-дан темизленди.Темизлев аналитик ольчюде ультраперформанслы сувлу хроматограф (Acquity, Waters) ярдымынен квадруполь масса эсасында детектор (QDa, Acquity, Waters) ярдымынен япылды, айны ЖК шараитлеринде, ВЭЖХ-МС/МС анализи коррекциясы япылгъанда. 3D20E22P эвельден бельгиленген тутув вакътында тапылды.Сонъра чыкъарылгъан бирикмелернинъ темизлиги юкъарыда тариф этильгени киби ВЭЖХ-МС/МС ярдымынен тешкерильди.
10-12 несиль осьтюрюв токъумаларындан я да беденнинъ башкъа къысымларындан (башсыз) истисалджынынъ косьтергичи боюнджа ТРИ реактиви (Термо Фишер) ярдымынен умумий РНК чыкъарылды.РНК ТУРБО ДНКаза (Термо Фишер) иле ишленди.cDNA синтез этильди followney murine transcript leukemia virus ( MolomoMsher re-V истисалджынынъ косьтергичи.Терс транскрипция микъдарий ПЦР ичюн праймерлер (RT-qPCR; 2-нджи кенишлетильген малюмат джедвели) эвельден нешир этильген эди24 я да Primer-BLAST26 къулланып уйдурылгъан эди, ольчюси 70-150 н.п. дёрт биологик репликация RT-qPCR ичюн сувда дёрт кере иритильди.Микъдар 15 мкл репликация реакцияларында япылды, оларнынъ теркибинде 1× PowerUp SYBR Green Master Mix (Thermo Fisher), праймерлер ве 5 мкл иритильген кДНК бар эди. ве малюматлар Design and Analysis (версия 2.4.3) къулланып топланды ве талиль этильди.Бу чалышмада косьтерильгени киби, нисбий микъдарлар рибосомалы RpL19 (AGAP004422) генине нормаллештирильди, онынъ экспрессиясы къаннен гъыдаланув 27 я да чыкъыш 3 иле эмиетли денъишмеди.
РНК кейфиети Agilent Bioanalyzer 2100 Bioanalyzer (Agilent) ярдымынен тешкерильди.Illumina чифт-уджлу китапханелери МИТ ве Гарварднынъ Брод институтында азырланды ве чалыштырылды.Секвенсирование окъувлары A. gambiae геномына (PEST штаммы, HAT 4.12 версиясы) uver5 иле уйгъунлаштырылды. параметрлери.Харита кейфиети (MAPQ) <30 олгъан окъувлар Samtools (версия 1.3.1) къулланып чыкъарылды.Генлерге хариталангъан окъувларнынъ сайысы стандарт параметрлернен htseq-count (версия 0.9.1) къулланып эсапланды.Нормализованные числа прочитаний были рассчитаны с expression DES azeever 1.28.1) R тилинде (4.0.3 версиясы).
Экдизонны денъиштирген ген намзетлери ильк оларакъ PSI-BLAST алгоритми (https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/2.8.1/) ярдымынен A. gambiae геномыны къыдырув ёлунен белли этильди, стандарт къыйметлерни къулланып Nocceque ( Параметрлер ашагъыдаки соргъунен НП_001038956.1), Musca domestica (ХП_005182020.1, ХП_005175332.1 ве ХП_011294434.1) ве Микроплит демоляторы (ХП_005182020.1, ХП_005182020.1) ве Микроплит демоляторы. XP_008552645.1) B. mori (Къошулма No NP_001036900), дрозофила меланогастер (Къошулма No NP_651202), Apis mellifera (Къошулма No XP_394838) ве НосумАкцесип (Ациртосип) махлюкъларындан ЭкК. ХП_001947166 олгъан); ве B. mori дан ЭПП (Къошулма No XP_001947166) NP_001177919.1 ве NP_001243996.1) ве D. melanogaster (Къошулма No NP_572986.1) дан ЭО (Къошулма No NP_572986.1) (фильтр0 эсасында юксек хит1) (1-нджи адым). фрагментлер/килобаз экзонлары миллион хариталангъан окъувгъа (ФПКМ) я да >85%) Гамбиядаки репродуктив токъумада (къадын ЛРТ я да МАГ) (2-нджи адым ). Спецификликни юксельтмек ичюн биз анофеллер чешити олгъан A. albimanus нинъ репродуктив токъумасында да экспрессиялангъан намзет ферментлерни сечип алдыкъ, олар чыкъыш вакътында экдизонны синтез этмейлер я да кочюрмейлер.Намзет генлер A. сонъки фильтр (4-юнджи адым), намзет генлер ашагъыдакилерден энъ азындан бирини къандырмакъ кереклер: (1) дифференциаль экспрессиялангъан генлернинъ талилине коре чыкъыштан сонъ эмиетли дереджеде юксельтильген (Р < 0,05) ве (2) репродуктив олмагъан токъумаларда (< 85 % я да <100 ФПКМ).
Биз эвельден тасвирленген усулларны 28,29,30 бутюн организмнинъ изотоплы маркировкасына иришмек ичюн денъиштирдик.Къыскъадан айткъанда, кийик типли Saccharomyces cerevisiae II типли (YSC2, Sigma) мая азот базасында (BD Difco, DF0335), теркибинде (Sigma2vol50, Sigma2vol5/) сынавдан кечирильди. 1,7% аминокислотасыз ве аммиак сульфаты. культура муити) ве 5% 15N аммиак сульфаты (NLM-713, >99%, Cambridge Isotope Laboratories) азотнынъ екяне менбасы оларакъ къулланылды.Мая центрифуга ёлунен къайтарылды ве чибин личинкалары кукла пейда олгъандже ad libitum бесленди) дёртюнджи инстар олюм.Сонъра тек дишилер нишансыз эркеклернен чыкъыш теджрибелеринде чыкъыш вакътында кочюрильген эркек протеомасыны талиль этмек ичюн къулланылды.
4-6 куньлюк 15N-белгиленген бакире дишилерни яшына келишкен бельгиленмеген бакире эркеклернен чыкъыш япмагъа меджбур эттилер.Мувафакъиетли чыкъыш эпифлюоресцент микроскопиясы ярдымынен чыкъыш тыкъынтыларыны тапып тасдыкъланды.3, 12 ве 24 л.с. аммиак бикарбонат буфери (рН 7,8) ве копчекнен гомогенлештирильди.Гомогенат центрифугагъа къоюлды ве супернатанты 50 мМ аммиак бикарбонатында 50 мкл 0,1%-ли RapiGest пеллети (186001860, Waters) иле къарыштырылды. гедже-куньдюз Вашингтон университетининъ МакКосс лабораториясына ёлланылды, анда LC-MS/MS ичюн нумюне азырлав битти.Пеллетни 50 мМ аммоний бикарбонатында 50 мкл 0,1% RapiGest ичинде гъайрыдан суспензия этинъиз ве сув ваннасында ультрасеснен чалынъыз. мМ дитиотреитол (ДТТ; Сигма), 15 мМ йодацетамид (Сигма) иле алкилленген ве 37 °С (1:0 50) температурада 1 саат девамында трипсинизациянен инкубация этильген: трипсин:субстрат нисбети).RapiGest 200 мМ 200 мМ HC5 температурада 200 мМ HC5 температурада 200 °С температурада 200 мМ HCl, 50 температурада 2000 °С температурада 200 °С температурада 2000 °С температурада 200 °С температурада 5 л °С температурада 10 дакъкъа девамында 14 000 айланув/дакъкъада центрифугалап, къалдыкъларны ёкъ этелер.Нумюнелер эки режимли къатты фазалы экстракция (Oasis MCX картриджлери, Waters) ярдымынен ювулды ве 0,1% мурджие экшилигинде гъайрыдан суспензияланды, сонъки протеин концентрациясы 0,33 мкг МАГ мкг MAG-лад1 олды. аналогик шекильде бакире эркеклерден талиль этильди.Эр бир нумюне ичюн эки аналитик репликация талиль этильди.Сонъра 25 см иритильген кремний 75 мкм колонкасы ярдымынен 4 см иритильген кремний Kasil1 (PQ) frit trap pack2d C. (Феноменекс) ве 180 дакъкъалыкъ сув хроматографиясы. Орнек дайджестлери – МС/МС наноACQUITY UPLC системасы (Waters) иле Q-Exactive HF масса спектрометринде (Thermo Fisher) чалыштырылды.Эр бир чалышув ичюн мейдангъа кетирильген малюматларнен багълы алув малюматлары Proteowizard (версия 3.0.2028 къаршы) къулланып mzML форматына чевирильди. FASTA малюмат базасы, анда Anopheles gambiae (VectorBase версиясы 54), Anopheles coluzzi махлюкъларындан акъсиллернинъ сырасы бар Мали-НИХ (VectorBase версиясы 54), Saccharomyces cerevisiae (Uniprot, март 2021 сенеси), A. кирлетиджилер.Пептидлернинъ харитасына келишкен ФДРлер Percolator32 (версия 3.05) ярдымынен 0,01 босагъасынен бельгиленди, ве пептидлер Limelight33 (2.2.0 версиясы) программасында акъсиллернинъ парсимониясы ярдымынен акъсиллернинъ айдынлатувларына джыйылды. эр бир чапувы эвельден тасвирленгени киби.Эр бир акъсилге нисбетен НСАФ эки чешит биологик репликадан алынгъан нумюнелер боюнджа орталама алынды.15N маркировкасы къадын протеомасыны мувафакъиетли маскалады, амма маркировкалангъан къызлардан аз микъдарда бельгиленмеген акъсил тапмакъ мумкюн эди.Биз нумюнелерде тек эркек акъсиллернинъ эксильмесини къайд эттик. техникий чапышмалар, анда чиг нумюнелер эркек/чифтлешюв нумюнелеринден сонъ чалыштырылды, ВЭЖХ «кечирюв» нетиджесинде.Маркировкалангъан къызлардан «кирлендириджилер» оларакъ тапылгъан ара-сыра акъсиллер 1-нджи къошма джедвельде берильген.
Генскриптте эки антиген пептид, QTTDRVAPAPDQQQ (ПА изотиплери ичинде) ве MESDGTTPSGDSEQ (ПА ве ПБ изотиплери ичинде).Эки пептид бирлештирильди, сонъра KLH ташыйыджы бельгисинен конъюгацияланды ве Янъы Зеландия тавшанларына инъекция япылды. аффинлик темизлеви ёлунен.Илеридеки вестерн-блоттинг ичюн энъ ЭПП-ге хас тавшандан алынгъан IgG къулланылды.
Вестерн-блотлар ичюн 4 куньлюк бакире эркеклерден ве бакире я да зорнен чыкъарылгъан дишилерден МАГ (n = 10, мында n биологик джеэттен мустакъиль чибин нумюнелерининъ сайысыны бильдире) ве диши ЛРТ (n = 30) (<10 чыкъыштан сонъ), Акъ чыкъарув буфери (50 мМ.НП0; 50 мМ Три.0; 0,25% натрий дезоксихолат;150 мМ NaCl; 1 мМ ЭДТА; 1× протеаза ингибиторы коктейли (Roche)) айрыджа къошулды.Нумюнелерни дискретлештирювден сонъ деръал бидернен гомогенлештирдилер (2 мм джам боюнджакълары, 2,40 мм дебриц). °С температурада 20 000 г центрифугалав.Акълар Бредфорд анализи (Bio-Rad) ярдымынен микъдарджа эсапланды.Сонъра 20 мкг МАГ акъикъы, 40 мкг ЛРТ акъикъы ве 20 мкг къалдыкъ джыйма акъикъы денатурирленди ве 10% MOPSferPA Bifferins u поливинилиденфторид мембраналары iBlot2 кочюрильме системасы (Thermo Fisher) ярдымынен япылды.Мембраналар 1× PBS-T (PBS-те 0,1% Tween-20) ичинде эки кере ювулды ве сонъра Odyssey блокирующий буферинде (Li-Cor) 22°C зияде °P rabbiom температурада 1 саат девамында блокланды. поликлональ биринджи антитело (блокировочный буферде 1:700) ве сычан анти-актин моноклональ биринджи антитело MAC237 (Abeam; 1:4,000).Мембраналар PBS-T иле ювулды ве сонъра экинджи антителоларнен (эшек анти-тавшан 800CW) (LT0CW ве эчки бо-6th) иле инкубация этильди. 1:20,000) 0,01% SDS ве 0,2% Tween -20 олгъан блокирующий буферде 22 °C температурада 1 саат девамында ерлештирильди.Мембраналар PBS-T иле ювулды ве Odyssey CLx сканеринде тасвирленди.Тесимлер Image Studio программасында топланды ве Image2D диапазонына коре (iPP диапазонына коре8). кДа) тапылмады.
ЭППнинъ (гистидин фосфатаза доменини къаврап алгъан AGAP002463-RB изоформасы оларакъ, NCBI консерватив домен къыдырувы 34) ве EcK2 (AGAP002181) кодлав регионлары pET-21a(+) плазмидасына (Novagen Millipore Sigma) клонланды ; праймерлер кенишлетильген малюматлар джедвелинде 2-нджи джедвельде берильген.pET-21a(+)-EcK2 конструкциясынынъ С-терминал 6xHis бирлеминден эвель секиз GS4 линкер (тандемде) къоюлды.NEBExpress улькесиз E. coli акъикъы синтези uLa purcombin реакциясы (N) ярдымынен рекомбинант акъикълар чыкъарылды. NEBExpress Ni спин колонкалары (New England BioLabs).Дигидрофолат редуктаза (DHFR) идаре акъикъы NEBExpress Cell-Free E. coli акъикъы синтези комплектинден ДНК шаблоны ярдымынен чыкъарылды.Акъикълар 50% глицеринде ПФС-те -20 °С температурада айгъадже сакъланды.
ЭПП ве токъума экстрактларынынъ фосфатаза фаалиети 4-нитрофенил фосфат (рНПП; Сигма-Ольдрих) ярдымынен ольченильди.Реакция буферинде 25 мМ Трис, 50 ​​мМ сирке экшилиги, 25 мМ Бис-Трис, 150 мМ NaCl, mEDTA1, mEDTA1 эди. реакция буферинде гомогенлештирильген ве ульке къалдыкълары центрифуга ёлунен чыкъарылгъан.Реакцияны 2,5 мг мл-1 рНПП олгъан реакция буферине фермент я да токъума экстракты къошып башламакъ керек.Реакция къарышмасыны ода араретинде къаранлыкъта инкубация этелер, ве рНППнинъ микъдарыны рНПП-ден микъдарджа эсаплайлар. 405 нм чешит вакъытларда ола.
In vitro ЭсК фаалиети ичюн акъсилни 200 мкл буферде (рН 7,5) 0,2 мг 20Е я да 3Д20Е иле инкубация этелер, онынъ теркибинде 10 мМ HEPES–NaOH, 0,1% BSA, 2 мМ АТФ ве 10 мМ MgCl2 °7C температурада 2 h температурада токътатылды. 800 мкл метанолны, сонъра -20 °С температурада 1 саат сувуттылар, сонъра 20 000 г температурада 10 дакъкъа девамында 4 °С температурада центрифугагъа къойдылар.Сонъра супернатантны ВЭЖХ-МС/МС ярдымынен талиль эттилер.Незарет группасында къулланылгъан акъикъатларны сыджакъ-инактивация этмек ичюн акъикъатларны Р02202020200002000000 температурада глицербагъа къойдылар. дакъкъа 95°С температурада ола.
In vitro ЭПП фаалиети ичюн акъсилни 3D20E22P (18 чифт МАГ-да расткельген микъдаргъа эквивалент, ВЭЖХ-МС/МС иле темизленген) 100 мкл буферде (рН 7,5) 25 мМ Трис, 50 ​​мМ Bi2M сирке экшилиги м00 м00 инкубация этелер. NaCl, 0,1 мМ ЭДТА ве 1 мМ ДТТ 27 °С температурада 3 саат девамында чыкъарылды.Реакцияны 400 мкл метанол къошып токътаттылар ве -20 °С температурада 1 саат девамында сувуттылар, сонъра 20 000 г температурада 10 дакъкъа девамында 4 °С температурада МССХ/д супертантыны центрифугагъа къойдылар.
ЭПП (362 н.п.), ЭсК1 (AGAP004574, 365 н.п.) ве ЭсК2 (556 н.п.) ичюн ПЦР фрагментлери къарышыкъ джынслы башсыз чибинлернинъ джесетлеринден азырлангъан кДНК-дан амплификация этильди.ЭГФП контрольнинъ ПЦР фрагменти (495 н.п. рСР2.1-еГФП олгъан; ПЦР праймерлери 2-нджи кенишлетильген малюмат джедвелинде берильген.ПЦР фрагменти pL4440 плазмидасындаки инверсиялы Т7 промоторлары арасында къоюлды.Плазмид конструкциялары NEB 5-α компетентли E. coli (New England Datasert Biolabs) махсулатларында тапылды ве къулланмаздан эвель DNA matchenced SurimPe1 секвенсированиеси ярдымынен тасдыкъланды (sese1). pL4440 эсасында япылгъан плазмидадан инсертни амплифика-ция этмек ичюн Т7 промоторына (кенишлетильген малюматлар джедвели 2) къулланылды.ПЦР махсулатынынъ колеми агарозалы гель электрофорези ярдымынен тасдыкъланды.dsRNA ПЦР шаблонларындан Megascript T7 Transcription Kit (Thermo Fisher) ярдымынен транскрипцияланды ве модификацияларнен темизленди. тасвирленген.
дсРНК инъекциясы ичюн 1380 нг дсРНК (dsGFP, dsEcK1, dsEcK2, dsEPP) 10 нг нл-1 концентрациясында буюк эркеклернинъ я да къадынларнынъ кокрекине инъекция этильди (Nanoject III, Drummond) эклозиядан сонъ 1 кунь ичинде лекдаун учь севиесинде репликатлар бельгиленди.Ген к РНК экстракциясы, кДНК синтези ве РТ-кПЦР.Экдизон инъекциясы ичюн 4 куньлюк я да 6 куньлюк къаннен бесленген дишилерге 0,13, 0,21, я да 0,63 мкг 20Е я да 3Д20Е концентрацияларында инъекция япылды. сырасынен, эксперименталь лейхагъа коре я да 6,3 нг нл-1.Сувгъа 100 нл 10% (об/об) этанолны инъекция этмек; 10%-ли этанолда 100 нл 3D20E22P (бир чифт МАГ-да расткельген микъдарнынъ 75%-ине тенъ келе).Сычанлар инъекция группасына тасавурлы шекильде тайинлендилер.
Йымырта къойув анализлери ичюн 3 куньлюк дишилерни инсан къанынен ad libitum беслей эдилер.Къысмен бесленген я да бесленмеген чибинлерни чыкъармакъ керек.Тедавийлевге коре, дишилерни дёрт гедже девамында айры йымырта къоюв чанакъларына къойдылар, къан ашындан сонъ энъ аздан 48 саат кечкен сонъ.Zeote a undercounted );0 чыкъкъан дишилер ичюн личинкагъа чыкъкъан йымырталар берекетли сайыла эди.
Чифтлешюв сынавлары ичюн дишилерге чыкъышкъа къаршы турмакъ ичюн тедавийге коре энъ аздан 2 кунь рухсет этильди, сонъра исе кийик типли яшкъа келишкен эркеклерни айны къафеске кирсеттилер.Эки геджеден сонъ дишилернинъ дёгюльген пузырьлери дискретлештирильди ве геномлы сербест буфер-ДНК a soni10 иле чыкъарылды. мМ Трис-НСl, 1 мМ ЭДТА ве 25 мМ NaCl (рН 8,2).Нумюнелер 55 °С температурада 15 дакъкъа девамында Протеиназа К (0,86 мкг мкл-1) иле инкубация этильди, сонъра 95 °С температурада 10 дакъкъа девамында субгеномлы дифолд ДНК-гъа азырланды. Y хромосома сыраларнынъ тапылмасы; праймерлер кенишлетильген малюмат 2-нджи джедвельде берильген.Y хромосома сырасы олмаса, чыкъыш олмагъаныны косьтере.
Янъыдан чыкъыш анализлери ичюн зорнен чыкъыш япкъан дишилернинъ чыкъыш статусыны тасдыкъламакъ ичюн чыкъыш тыкъынтылары олгъаныны тешкердилер ве 2 кунь ичинде эркеклер олмагъанда чыкъышкъа къаршы турув инкишаф этмеге рухсет эттилер, бу акъта эвельден тасвирленген эди 36 .Males caring DsRed transgenic sperm were then fermater la fermater la fermawT into then introduced. дишилерден пузырьчиклер дискретлештирильди, геномлы ДНК юкъарыда тасвирленгени киби азырланды ве DsRed трансгенининъ qPCR тапмасына огъратылды; праймерлер 2-нджи джедвельде берильген.DsRed трансгенининъ олмамасы янъыдан чыкъыш олмагъаныны косьтере эди.
3D20E эвельден тасвирленгени киби синтез этильди 37 .Къыскъадан айткъанда, 10 мг 20Е (Сигма-Ольдрих) 10 мл сувда иритильди, сонъра 30 мг платина къарасы (тоз шеклинде, Сигма-Ольдрих) къошулды. ода араретинде къарыштырыла.6 сааттан сонъ реакцияны токътатмакъ ичюн 30 мл метанол къошула.Къарышма катализатор парчачыкъларыны чыкъармакъ ичюн центрифугагъа къоюла.Супернатантны ода араретинде вакуумда къуругъандже бувландыралар.Къурутылгъан реакция махсулаты 1%МСханол/МСханол ичюн иритиле. талиль.Конверсия тезлиги (20Е-ден 3Д20Е-гедже) тахминен 97% тешкиль эте (4б рес.), синтез этильген 3Д20Енинъ МС спектри исе чыкъарылгъан дишилерде расткельгенине келише эди (4в рес.).
Эфсанеде япылгъан статистик тестлернинъ конкрет тафсилятлары берильген.Фишернинъ догъру тестини, Мантель-Кокс тестини ве Студентнинъ t-тестини япмакъ ичюн GraphPad (версия 9.0) къулланылды.Кохран-Мантель-Хенсель тестлери махсус R скрипти ярдымынен япылды (1.0. https://github.com/duopeng/mantelhaen.test).Малюматларнынъ даркъалувы нормальликке коре Шапиро-Уильк тести ярдымынен сынавдан кечирильди (0,05 эмиетлик босагъасынен.Малюматлар нормальлик тестинде енъильгенде, Манн-Уитни тести япылды.Сагъ къалув малюматлары patel-Esq 1.28.1) RNA-seq ген севиесинде дифференциаль экспрессия талилини япмакъ ичюн къулланылды.Графиктеки горизонталь сызакъ медиананы косьтере.Бутюн тестлер ичюн босагъа оларакъ Р = 0,05 эмиетлик къыймети къулланылды.
Тедкъикъатнынъ лейхасы акъкъында даа чокъ малюматны бу макъалеге багълангъан «Табиат араштырмалары акъкъында рапорт» тезисинден алмакъ мумкюн.
МС протеомик малюматлар PRIDE шерик хазинеси (https://www.ebi.ac.uk/pride/) вастасынен ProteomeXchange консорциумына (http://proteomecentral.proteomexchange.org) PXD032157 малюматлар топламынынъ идентификаторы иле ерлештирильди.
RNA-seq малюматлар топламы GSE198665 сериялы язысы алтында Ген экспрессиясы эр тарафлама китапханесинде (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) сакълана.
Бугуньки чалышма девамында мейдангъа кетирильген ве/я да талиль этильген къошма малюматлар топламыны акъыллы риджа боюнджа уйгъун муэллифлерден алмакъ мумкюн.Бу макъаледе менба малюматлары берильген.
Де Луф, А. Экдистероидлер: Итибарсыз боджеклернинъ джынс стероидлери?Эркек: Къара къуту.Боджеклер акъкъында илим.13, 325–338 (2006).
Редферн, КПФ 20-гидроксиэкдизон ве Anopheles stephens махлюкъларында йымырталыкъларнынъ инкишафы.Дж. Боджеклернинъ физиологиясы.28, 97–109 (1982 с.).