Секретор ёлда акъсиллернинъ сыраланмасы улькенинъ компартментациясыны ве гомеостазыны сакъламакъ ичюн пек муимдир. Къабукъ вастасынен сыралавдан гъайры, секретор ташув джерьянында кинезин сыралавында липидлернинъ ролю чокътан берли джевап берильмеген эсас суальдир. Мында биз 3D бир вакъыттаки чокъ ренкли юксек ифаделиликтеки акъикъий вакъытта тасвирлевни япып, янъы синтез этильген гликозилфосфатидилинозитол-иммобилизациялангъан пек узун керамид липид къысымлары олгъан акъикъатлар кластерлештирильгенини ве махсус эндоплазмаларгъа тасниф этильгенини исбатлаймыз. Бундан да гъайры, биз эндоплазматик сетки зарындаки керамиднинъ зынджыр узунлыгъы бу сыралав селективлиги ичюн пек муим олгъаныны косьтеремиз. Бизим чалышмамыз липид зынджырынынъ узунлыгъына эсасланып, акъсил юклерини секретор ёлундаки селектив экспорт ерлерине тасниф этмек ичюн биринджи догърудан-догъру in vivo делильни кетире.
Эукариот улькелеринде эндоплазма сетинде (ЭС) синтез этильген акъсиллер сонъра озьлерине уйгъун ульке ерине еткизмек ичюн секретор ёлдан ташув вакътында сыралана (1). Къатлам вастасынен сыралавдан гъайры, белли бир липидлернинъ, оларны специфик акъсиллернинъ специфик мембраналы доменлерине топлап, селектив чыкъыш нокъталары оларакъ да хызмет эте биледжеги чокътан тахмин этиле эди (2-5). Лякин бу ола бильген липидлерге эсаслангъан механизмни исбатламакъ ичюн догърудан-догъру in vivo делиллери даа етишмей. Бу эсас меселени чезмек ичюн биз маяларда гликозилфосфатидилинозитол (ГФИ) анкерленген акъикъатлар (ГФИ-АП) ЭР-ден насыл этип дифференциаль шекильде чыкъарылгъаныны огрендик. ГПИ-АП — бу липидлернен багълы олгъан чешит тюрлю ульке юзюнинъ акъикъатларыдыр ( 6, 7). ГПИ-АП — гликолипид къысмы (ГПИ анкери) вастасынен плазма зарынынъ тышкъы япракъчыкъларына япышкъан чыкъарылгъан акъсилдир. Олар ГПИ анкерлерини ЭР люменинде консерватив трансляциядан сонъки модификациялар оларакъ къабул этелер (8). Япышкъан сонъ ГПИ-АП Гольджи аппаратындан (5, 9) ЭР-ден плазма зарына кече. ГПИ анкерлерининъ олмасы ГПИ-АП-нинъ трансмембраналы секретленген акъикъатлардан (оларнынъ арасында плазма зарларынынъ башкъа акъикъатларындан) айрыджа секретор ёл боюнджа ташылмасына себеп ола (5, 9, 10). Мая укюретлеринде ГПИ-АП эндоплазма сеткисиндеки башкъа чыкъарылгъан акъсиллерден айырыла, сонъра исе II къаплама акъсил комплекси (КОПИИ) иле сарылгъан уникаль пузырьчиклерге пакетлене (6, 7). ЭР экспорт джерьянында бу таснифлев джерьянынынъ детерминантлары ачыкъ дегиль, амма бу механизм липидлерни, хусусан ГПИ анкерининъ липид къысмынынъ къурулыш джеэттен гъайрыдан шекиллендирильмесини талап эте биледжеги тахмин этиле (5, 8). Маяда ГПИ липидлерининъ гъайрыдан шекилленюви ГПИ япышкъан сонъ деръал башлана ве чокъ алларда бу керамиднинъ 26 углеродлы узун зынджырлы тоюндырылгъан ягъ экшилигине (С26:0) багъланмасына себеп ола (11, 12). С26 керамиди шимдиге къадар мая укюретлери тарафындан чыкъарылгъан эсас керамидтир. О, ЭР-де синтез этиле ве онынъ чокъусы COPII пузырьлери вастасынен Гольджи аппаратына чыкъарыла (13). ГПИ-АП-нинъ ЭР экспорты махсус оларакъ девамлы керамид синтезини талап эте (14, 15), озь невбетинде, Гольджи аппаратында керамиднинъ инозитол фосфат керамидине (ИФК) чевирильмеси ГПИ анкер синтезине багълыдыр (16). Суний зарларнен япылгъан биофизик чалышмалар пек узун ацил зынджырлы керамидлер бирлешип, текрарланмаз физик хусусиетлерге малик тертипли доменлерни мейдангъа кетире биледжегини косьтере (17, 18). Бу малюматлар бойле гипотезагъа кетире ки, С26 керамид ве С26 керамиднен ГПИ-АП озь физик хусусиетлерини къулланып, нисбетен къарышыкъ ЭР мембраналы липид муитинде тертипли регионларгъа я да регионларгъа бирлешелер. О, эсасен къыскъа ве тоюнмагъан глицеролипидлерден (С16:1 ве С18:1) ибарет (19, 20). Бу регионлар сечип алув ёлунен специфик ЭР чыкъыш ерлерине (ЭРЭС) дикъкъат айырыладжакъ, анда керамид ве керамид эсасында ГПИ-АП айны айрыджа COPII пузырькасында Гольджиге бераберликте ташыла биле (5).
Бу тедкъикъатта биз бу липидлер эсасында япылгъан механизмни догърудан-догъру супер-айдынлыкълы конфокаль акъикъий вакъытта тасвирлев микроскопиясы (SCLIM) къулланып сынадыкъ, бу - энъ юксек дереджедеки ульке микроскопиясы усулыдыр, о, айны вакъытта флюоресцент бельгиленген акъикъатларны козете биле Учь ренкли ве учь ольчюли lipelu юксек айдынлыкълы s (21, 22) ола.
Биз ильк оларакъ SCLIM технологиясыны къулланып, S. cerevisiae махлюкъында ЭР-ден чыкъкъан сонъ трансмембраналы чыкъарылгъан акъикъатлардан С26 керамид группасы олгъан нормаль ГПИ-АП насыл скрининг япылгъаныны даа да зияде бельгиледик. ЭРнинъ таснифини тешкермек ичюн биз ин виво шекильде ЭРЭСке кирген янъы синтез этильген юкни догърудан-догъру корьгезмеге имкян берген генетик системаны къулландыкъ (7, 23). Юк оларакъ биз С26 керамид эсасында ешиль флюоресцент акъ (ГФП) иле бельгиленген GPI-AP Gas1 ве якъын инфракъырмызы флюоресцент акъ (iRFP) иле бельгиленген трансмембраналы секретирленген Mid2 акъыны сечип алдыкъ, оларнынъ экиси де плазма зарыны нишан алалар (24–26). sec31-1 араретке сезимли мутантында бу эки юк галактоза индукциясы япкъан промотор ве конститутив ЭРЭС маркери алтында ифаделене. Экстремаль араретте (37°С), чюнки sec31-1 мутациясы COPII къаплама компонентининъ Sec31 COPII осьмесини ве ЭР экспортыны ингибирлемек вазифесине тесир эте, янъы синтез этильген юк ЭР-де топлана (23). Алчакъ араретке (24°С) сувутылгъан сонъ, sec31-1 мутант улькелери секретор мейданындан озюни таптылар ве топлангъан янъы синтетик юк ЭР-ден тышкъа чыкъарылып башлады. CLIM визуализациясы янъы синтез этильген Gas1-GFP ве Mid2-iRFPнинъ чокъусы 37°С температурада инкубациядан сонъ sec31-1 мутант улькелерининъ ЭР-де даа топлангъаныны ве сонъра 24°С температурада 5 дакъкъа девамында чыкъкъаныны косьтере (1 рес.). Mid2-iRFP бутюн ЭР зарында даркъалгъаны ичюн, Gas1-GFP исе узюльмез ЭР зарында топлангъаны ве топлангъаны ичюн, оларнынъ даркъалувы бутюнлей башкъадыр (1 рес., А-дан С-гедже ве Movie S1). Бундан да гъайры, 1D рес-де косьтерильгени киби, Gas1-GFP кластеринде Mid2-iRFP ёкъ. Бу нетиджелер ГПИ-АП ве трансмембраналы акъикъатлар чешит ЭР мембраналы регионларгъа эрте айырылгъаныны косьтере. Gas1-GFP кластери mCherryнинъ COPII къаплама акъикъы Sec13 иле бельгиленген специфик ЭРЭС-ке янаша ерлешкен (1 рес., Е ве Ф, ве S1 фильми) (23).
sec31-1 улькелери галактоза иле индукциялангъан секрецияларны, узун ацил зынджыры (С26) керамиди GPI-AP Gas1-GFP (GPI-AP, ешиль) ве трансмембраналы Mid2-iRFP бельгисини (ТМП, кок) ифаде этелер ве бу Конструктив ERES маркировкасы Sec13-mES3 1990 сенеси magentabated (2000) дакъкъадан сонъ 24°С-ке авуштырылды ве 5 дакъкъадан сонъ SCLIM ярдымынен тасвирленди. (А дан С) тюзлюкнинъ темсилий бирлештирильген я да бир 2D тасвири (А), 10 z-кесикнинъ 2D проекция тасвири (В) я да юк ве ЭРЭС маркерлерининъ 3D ульке ярымкурреси тасвири (С) косьтериле. Шкала панелинде 1мкм (А ве В). Шкала бирлеми 0,551 мкм (С) ола. Gas1-GFP дискрет ЭР регионларында я да кластерлеринде тапылды, Mid2-iRFP исе тапылды ве бутюн ЭР зарында даркъалды (С). Г) Графикте беяз окъ сызыгъы боюнджа (сол тарафта) Gas1-GFP кластеринде Gas1-GFP ве Mid2-iRFP нисбий флюоресценция интенсивлиги косьтерильген. АУ, ихтиярий бирлем. (Е ве Ф) мал ве ЭРЭС бельгисини бирлештирген 3D тасвирни косьтере. Специфик ЭРЭС янында Gas1-GFP кластерлери тапылды. Шкала бирлеми 0,551 мкм. Е) Беяз къатты окънен ЭРЭСнен багълы олгъан Gas1-GFP кластери къайд этиле. Орта ве сагъ панельлерде бирлештирильген буюклештирильген 3D тасвир ве сечильген Gas1-GFP кластерининъ айландырылгъан корюниши косьтериле.
Gas1-GFP кластери ве белли бир ERES арасындаки якъын фезаий багъ Gas1-GFP селектив ERES-ке кире биледжегини косьтере, бу исе Mid2-iRFP ER-ден чыкъмакъ ичюн къуллангъан селективликтен фаркъ эте. Бу имкянны ёкъ этмек ичюн биз тек бир я да эки мал ичюн ЭРЭС нисбетини микъдарджа эсапладыкъ (2 рес., А - С). Биз ЭРЭСнинъ чокъусында (70%) тек бир тюр юк олгъаныны таптыкъ. 2С ресимнинъ ашагъыдаки ресиминде тек Gas1-GFP (1 рес.) я да тек Mid2-iRFP (2 рес.) олгъан ЭРЭСнинъ эки типик нумюнеси косьтерильген. Аксине, ЭРЭСнинъ тахминен 20%-де бир ерде къаплангъан эки юк бар. Базы ЭРЭСлерде (10%) эки тюрлю юк олгъаны тапылды, амма олар ачыкътан-ачыкъ чешит ерлерде айырылгъан эдилер. Демек, бу статистик талиль ЭР экспорт этильген сонъ, ГПИ-АП Gas1-ГФП ве трансмембраналы юк Mid2-iRFP чешит ЭРЭСлерге болюнгенини косьтере (2D рес.). Бу сыралав семерелилиги эвельки биохимик талиль (6) ве морфологик бельгилев (7) иле пек келише. Биз ЭРЭС-ке кирген карантинге алынгъан юкнинъ давранышыны да козете билемиз (2Е рес. ве S2 фильми). 2Е рес-де корюне ки, тек бир кичик бир къысмы Gas1-GFP (3 панель) я да Mid2-iRFP (4 панель) ЭРЭС-ке бир тарафтан кире ве айры бир ерде сынъырлана. 2Е ресимнинъ 5-нджи панелинде корюне ки, Gas1-GFP ве Mid2-iRFP базыда бир ЭРЭС-те расткелелер, амма олар чешит тарафлардан кирелер ве айры регионларда топлана, олар чешит COPII пузырьчиклерини ифаде эте билелер. Биз де тасдыкъладыкъ ки, С26 керамид эсасында GPI-AP Gas1нинъ козетильген айырылувы ве селектив ERES оларакъ таснифи спецификтир, чюнки даа бир трансмембраналы секреция юкю, GFP-белгиленген плазма мембранасынынъ Axl2 акъикъы (27 ), Mid2-iRFP-ге бенъзеген арекетлерни косьтере. (С1 ресими ве С3 фильми). Янъы синтез этильген Axl2-GFP Mid2-iRFP киби ER зарындан кечип даркъала (S1, А ве В ресимлери), ве ERESнинъ чокъусында Mid2-iRFP иле берабер локализациялана (S1, B ресимлери, В дан D гедже). рес-нинъ 1 ве 2 панеллеринде S1C эки трансмембраналы юк бири-бирине уйгъан ЭРЭСнинъ эки типик нумюнеси косьтериле. Бу алларда эки мал да ЭРЭС-ке берабер кире (С1Е рес., 3-юнджи панель ве С3-юнджи фильм).
Галактоза индукциясы олгъан секрецияларны ифаделеген sec31-1 улькелери, Gas1-GFP (GPI-AP, ешиль) ве Mid2-iRFP (ТМП, кок) ве конститутив ERES маркировкасы Sec13-mCherry (ERES, мор) 37 °C температурада 30 дакъкъагъадже секрецияны инкубациядан сонъ °2 °2 чыкъарувгъадже ерлештирдилер. блок, ве 20 дакъкъадан сонъ SCLIM иле ресим япынъыз. (А дан С) юкнинъ ве ЭРЭС иле бельгиленген 10 z-кесикнинъ темсилий 2D проекция тасвирлери (А; масштаб панелинде, 1 мкм) я да 3D ульке ярымкурреси тасвирлери (В ве С; масштаб бирлеми, 0,456 мкм). (В) ресимдеки ашагъы панельде ве (С) ресимдеки ашагъы панельде тек ЭРЭС (магента) [Gas1-GFP (боз) ве Mid2-iRFP (ачыкъ кок)] ичинде олгъан малларны косьтермек ичюн ишленген тасвирлер косьтериле. В) Ачыкъ окъ: ЭРЭС тек бир юкни (1-ден 4-кедже) ташымакъта. Боз окъ: ЭРЭС-те айры юк бар (5). Беяз къатты окъ: ичинде бир ерде ерлешкен юк олгъан ЭРЭС. Ашагъыда: сечильген тек ЭРЭС-те тек Gas1-GFP (1) я да Mid2-iRFP (2) бар. Шкала панелинде, 100 нм. Г) В рес-де тасвирленген фотомикрографиянынъ микъдарыны бельгилемек. Тек бир юк (Gas1-GFP я да Mid2-iRFP), айры юк ве бири-бирине къаплангъан юк олгъан ЭРЭСнинъ орта фаизи. Учь мустакъиль теджрибеде 54 улькеде n=432. Хата ёлакъ = СД. Эки къуйрукълы чифтсиз т тести. *** Р = 0,0002 ола. Д) (С) иле бельгиленген карантинге алынгъан юкнинъ сечильген ЭРЭС-ининъ 3D тасвири. Gas1-GFP (ешиль) (3) я да Mid2-iRFP (мавы) (4) бир тарафтан ЭРЭСке (магент) кире ве ЭРЭС ичиндеки кичик бир мейданлыкънен сынъырлана. Кимерде юкнинъ эки чешити де бир тарафтан бир ЭРЭС-ке (5) кире ве ЭРЭС ичиндеки айры бир ерде сынъырлана. Шкала панелинде, 100 нм.
Сонъра биз ЭР зарында булунгъан узун ацил зынджырлы керамид (С26) Gas1нинъ селектив ЭРЭС-ке специфик кластерлешмесини ве сыраланувыны идаре эте, деген гипотезаны сынадыкъ. Бунынъ ичюн биз GhLag1 модификациялангъан мая штаммыны къулландыкъ, онда эки эндоген керамид синтазасы Lag1 ве Lac1 GhLag1 (памукънынъ Lag1 гомологы) иле денъиштирильди, нетиджеде кийик типтен къыскъа олгъан ульке зарлы Ceramide штаммы олгъан мая штаммы пейда олды (3А рес.) (2). Кутьлевий спектрометрия (МС) талили шуны косьтере ки, кийик типли штаммларда умумий керамиднинъ 95%-и пек узун (С26) зынджырлы керамид, GhLag1-де исе керамиднинъ 85%-и пек узун (С18 ве С16) ола. ), керамиднинъ тек 2%-и пек узун (С26) зынджырлы керамидтир. GhLag1 зарында шимдиге къадар тапылгъан эсас керамидлер С18 ве С16 керамидлери олсалар да, МС анализи де GhLag1 штаммында ифаделенген Gas1-GFPнинъ GPI анкеринде кийик типли липидлернен тенъештириле бильген С26 керамиди олгъаныны тасдыкълады. Кефильлиги де айны (3, А рес.) (26). Демек, бу, керамидлерни гъайрыдан шекиллендирюв ферменти Cwh43 С26 керамиди ичюн юксек селективликке малик олгъаныны анълата, 26 рес-де косьтерильгени киби, о, GhLag1 штаммындаки аз микъдарда С26 керамидинден ГПИ анкерини имтиязлы шекильде кирсете. С2 (29) ола. Бунъа бакъмадан, GhLag1 ульке зарында эсас оларакъ тек С18-С16 керамиди бар, Gas1-GFP исе даа С26 керамиди бар. Бу факт бу штаммны ЭР-деки мембраналы керамиднинъ ацил зынджыры узунлыгъы меселесини махсус чезмек ичюн идеаль алетке чевире. Сыныф ве сыралавнынъ фарзий ролю. Сонъра, биз ильк оларакъ С26 Gas1-GFP нинъ GhLag1 ичинде араретке сезимли мутант аллели олгъан sec31-1 кластерлерде топланув къабилиетини адеттеки флюоресцент микроскопиясы вастасынен огрендик, мында тек узун (С18-С16) зынджыр ER мембранасынынъ Ceramide бар (3 рес.). Биз козьде туттыкъ ки, sec31-1-де Gas1-GFPнинъ чокъусы кластерлерде топлангъан, узун (С18-С16) узун керамид ER зарлы sec31-1 GhLag1-де исе Gas1-GFP эсасен кластерленмеген ве бутюн ER зарында даркъалгъан. Догърусыны айткъанда, С26 керамид эсасында кластерлештирюв специфик ЭРЭС-нен якъындан багълы олгъаны ичюн (1 рес.), биз невбеттеки джерьянда ЭР экспорт акъикъы механизмининъ функциясы да иштирак эте биледжегини тешкердик. ГПИ-АП ЭР экспорты ичюн махсус COPII системасыны къуллана, о, ГПИ анкерининъ гликан къысмынынъ Ted1′нинъ къурулышлы гъайрыдан шекиллендирильмесинен фааль суретте идаре этиле (30, 31). Сонъра рекомбинант ГПИ-гликан трансмембраналы юк рецепторы р24 комплекси тарафындан таныла, о исе озь невбетинде COPII юк багълайыджы Sec24 эсас суббирлигининъ специфик изоформасы олгъан Lst1-ни сечип алув ёлунен чалышмагъа ала ве GPI-AP-ге зенгин COPII Vesicles are necessary (31) мейдангъа кетире. Шунынъ ичюн биз бу тек акъикъатларнынъ (р24 комплекс компоненти Emp24, GPI-гликанны гъайрыдан шекиллендирюв ферменти Ted1 ве специфик COPII алтбирлиги Lst1) делециясыны sec31-1 мутант штаммынен бирлештирген эки къатлы мутант къурдыкъ ве оларны огрендик GFP1-cluster шекиллендирмек мумкюнми (Рес. GFP1-clu3). Биз sec31-1emp24Δ ве sec31-1ted1Δ-де Gas1-GFP эсасен кластерсиз ве бутюн ER зарында даркъалгъаныны козьде туттыкъ, буны эвель sec31-1 GhLag1-де корьген эдик, sec31-1lst1Δ-де исе Gas1-GFP Like sec. Бу нетиджелер, ЭР зарында С26 керамидининъ олмасындан гъайры, Gas1-GFP кластерлешмеси де p24 комплексине багъланмакъ кереклигини косьтере, ве бунъа специфик Lst1 рекрутинг керекмей. Сонъра, биз ЭР зарындаки керамиднинъ зынджыр узунлыгъы Gas1-GFPнинъ p24-ке багъланувыны низамлай биледжеги имкяныны араштырдыкъ. Лякин биз С18-С16 керамидининъ мембранада олмасы р24 комплекси тарафындан реконструкция этильген ГПИ-гликанларгъа (С3 ве С4, А ве В ресимлери) я да ГПИ-АП-ке багъланувгъа ве ГПИ-АП-ны экспорт этмеге тесир этмегенини таптыкъ. къабилиет. COPII Lst1 алт чешитини чалышмагъа алынъыз (С4С рес.). Демек, С26 керамидке багълы кластерлештирюв чешит ЭР экспорт акъсил механизмлеринен акъсиллернинъ тесирлешювини талап этмей, амма липидлернинъ узунлыгъынен идаре этильген альтернатив сыралав механизмини дестеклей. Сонъра, биз ЭР зарындаки керамид ацил зынджырынынъ узунлыгъы Gas1-GFP-ни селектив ЭРЭС оларакъ эффектив тасниф этмек ичюн муим олгъаныны талиль эттик. Къыскъа зынджырлы керамидли GhLag1 штаммындаки Gas1 ЭР-ден чыкъып, плазма зарына киргени ичюн (S5 рес.), биз бойле тюшюнемиз ки, эгер сыралав керамид ацил зынджырынынъ узунлыгъынен идаре этильсе, GhLag1 штаммындаки Gas1 янъыдан ёнельтиле ве кечиле биле. Айны зарлы ЭРЭС маллары.
А) GhLag1 ульке зарында эсасен даа къыскъа С18-С16 керамидлери бар, Gas1-GFP анкеринде исе кийик типли улькелердеки киби С26 ИПК даа бар. Юкъарыда: кийик типли (Wt) ве GhLag1p штаммларнынъ ульке зарындаки керамиднинъ ацил зынджыры узунлыгъынынъ масса спектрометриясы (МС) ярдымынен талили. Малюматлар умумий керамиднинъ фаизини косьтере. Учь мустакъиль теджрибенинъ орталамасы. Хата ёлакъ = СД. Эки къуйрукълы чифтсиз т тести. **** Р <0,0001 ола. Ашагъыдаки панель: кийик типли ве GhLag1p штаммларында ифаделенген Gas1-GFP (GPI-IPC) GPI анкеринде булунгъан IPCнинъ ацил зынджыры узунлыгъынынъ МС талили. Малюматлар умумий ИПК сигналынынъ фаизини косьтере. Беш мустакъиль теджрибенинъ орталамасы. Хата ёлакъ = СД. Эки къуйрукълы чифтсиз т тести. нс, муим дегиль. Р = 0,9134 ола. Б) галактоза иле индукциялангъан Gas1-GFP экспрессиясы олгъан sec31-1, sec31-1 GhLag1, sec31-1emp24Δ, sec31-1ted1Δ ве sec31-1lst1Δ улькелерининъ флюоресцент микрографиялары 37°С температурада ашагъы пассценциягъа къадар рутинге къадар инкубация этильди. 24°С-тен сонъ ола. Беяз окъ: ЭР Газ1-ГФП кластери. Ачыкъ окъ: Кластерсиз Gas1-GFP бутюн ЭР зарында даркъалгъан, ЭР-ге хас олгъан озек алкъа бояланувыны косьтере. Шкала панелинде, 5мкм. В) В рес-де тасвирленген фотомикрографиянынъ микъдарыны бельгилемек. Нокъталы Gas1-GFP къурулышы олгъан улькелернинъ орта фаизи. Учь мустакъиль теджрибеде n≥300 ульке. Хата ёлакъ = СД. Эки къуйрукълы чифтсиз т тести. **** Р <0,0001 ола.
Бу меселени догърудан-догъру чезмек ичюн биз GhLag1-де Gas1-GFP ве Mid2-iRFP-нинъ sec31-1 араретке сезимли мутант аллелинен SCLIM визуализациясыны яптыкъ (4 рес. ве Movie S4). ЭР 37°С температурада тутулгъан сонъ ве сонъра 24°С температурада чыкъарылгъан сонъ, янъы синтез этильген Gas1-GFPнинъ чокъусы топланмай ве бутюн ЭР зарында даркъалмай, буны адий микроскоплар козьде тута (4, А ве В рес.). Бундан гъайры, ЭРЭСнинъ буюк бир фаизине (67%) онда бирликте ерлешкен эки тюрлю юк кире (4Г рес.). 4С ресимнинъ 1 ве 2 панеллеринде Gas1-GFP ве Mid2-GFP къаплангъан ЭРЭСнинъ эки типик нумюнеси косьтерильген. Бундан гъайры, эки мал да бир ЭРЭС-ке алынды (4Е рес., 3-нджи панель ве S4 фильми). Демек, бизим нетиджелеримиз ЭР зарындаки керамид ацил зынджырынынъ узунлыгъы ЭР акъсиллерининъ агрегациясы ве таснифининъ муим детерминанты олгъаныны косьтере.
Галактоза иле индукциялангъан секрецияларны ифаделеген Sec31-1 GhLag1 улькелери, Gas1-GFP (GPI-AP, ешиль) ве Mid2-iRFP (ТМП, кок) ве конститутив ERES-белгиленген Sec13-mCherry (ERES, мор) 37°С температурада инкубация этиле. дакъкъа девамында 24°С температурагъа тюшюрип, секретлерни чыкъарынъыз ве 20 дакъкъадан сонъ СКЛИМ иле тасвирленъиз. (А дан С) юк ве ЭРЭС иле бельгиленген 10 z-кесикнинъ темсилий 2D проекция тасвирлери (А; масштаб панелинде, 1 мкм) я да 3D ульке ярымкурреси тасвирлеринде (В ве С; масштаб бирлеми, 0,45 мкм). (В) ресимдеки ашагъы панельде ве (С) ресимдеки ашагъы панельде тек ЭРЭС (магента) [Gas1-GFP (боз) ве Mid2-iRFP (ачыкъ кок)] ичинде олгъан малларны косьтермек ичюн ишленген тасвирлер косьтериле. В) Беяз толдурылгъан окъ: ЭРЭС, маллар бири-бирине къошула. Ачыкъ окъ: ЭРЕС тек бир шейни къабул эте. Ашагъы панель: Сечильген ЭРЭС-те (С) иле къайд этильген бир-бирине къаплангъан маллар (1 ве 2) бар. Шкала панелинде, 100 нм. Г) В рес-де тасвирленген фотомикрографиянынъ микъдарыны бельгилемек. sec31-1 ве sec31-1 GhLag1 агрегатларында тек бир юк (Gas1-GFP я да Mid2-iRFP) кирсетильген, айры юк ве къаплангъан юк ичюн исе ЭРЭСнинъ орта фаизи. Учь мустакъиль теджрибеде 54 улькеде n = 432 (сек31-1) ве 47 улькеде n = 430 (сек31-1 GhLag1) тапылды. Хата ёлакъ = СД. Эки къуйрукълы чифтсиз т тести. *** Р = 0,0002 (сек31-1) ве ** Р = 0,0031 (сек31-1 ГхЛаг1). Д) (С) иле къайд этильген юк (3) иле сечильген ЭРЭСнинъ 3D тасвири. Gas1-GFP (ешиль) ве Mid2-iRFP (мавы) бир тарафтан ЭРЭС (магента) якъынлашалар ве бир ЭРЭС сынъырлангъан ерде къала. Шкала панелинде, 100 нм.
Бу чалышма липидлер эсасында япылгъан акъсиллернинъ юклери секретор ёлунда селектив экспорт ерлерине тасниф этильгени акъкъында догърудан-догъру in vivo делиль кетире ве тасниф селективлиги ичюн ацил зынджырынынъ узунлыгъынынъ эмиетини ачыкълай. SCLIM адлы кучьлю ве энъ юксек микроскопия усулыны къулланып, биз янъы синтез этильген Gas1-GFP (чокъ узун ацил зынджыры (С26) керамид липид къысмы олгъан эсас плазма зарасы GPI-AP) маяда косьтердик ) дискрет трансмбраналы ЭРлер ярдымынен таркъалгъан регионлар дискрет трансмбраналы ЭР иле багълыдыр, ЭР зарыны (1 рес.). Бундан да гъайры, бу эки тюрлю мал чешит ЭРЭС-лерге сечип алув ёлунен кире (2 рес.). Мембранадаки ульке керамидининъ ацил зынджырынынъ узунлыгъы С26-дан С18-С16-гъа эндириле, Gas1-GFP кластери дискрет ЭР регионына бозула ве Gas1-GFP айны ЭР-ден кечип, трансмембраналы акънен ЭР-ден чыкъмакъ ичюн янъыдан ёллана (3 рес. ве 3 рес.). 4).
ГПИ-АП ЭР-ден чыкъмакъ ичюн махсуслаштырылгъан акъсиллернинъ механизмини къулланса да, биз С26 керамидке багълы айырылма ЭРЭСнинъ ихтисаслашувына кетире биледжек дифференциаль акъсиллернинъ тесирлешювлерине эсасланмагъаныны таптыкъ (S4 ве S5 ресимлер). Онынъ ерине бизим тапмаджаларымыз липидлер эсасында акъсиллернинъ кластерлешмеси ве сонъра башкъа юклернинъ чыкъарылмасы иле идаре этильген альтернатив таснифлев механизмини тасдикълай. Бизим козетювлеримиз, белли бир ЭРЭСнен багълы олгъан Gas1-GFP регионы я да кластеринде трансмембраналы чыкъарылгъан Mid2-iRFP бельгиси ёкъ олгъаныны косьтере, бу исе С26 керамидке багълы ГПИ-АП кластери оларнынъ уйгъун ЭРЭСке кирмесини къолайлаштыргъаныны косьтере, айны вакъытта, бу хусусий трансмембраналы секрецияларны чыкъараджакъ TheES1 рес. 2). Аксине, ЭР зарында С18-С16 керамидлернинъ олмасы ГПИ-АП-нынъ регионлар я да кластерлер мейдангъа кетирмесине себеп олмай, шунынъ ичюн олар трансмембраналы чыкъарылгъан акъикъатларны айны ЭРЭС-ке чыкъармайлар я да денъиштирмейлер (3 ве 4 рес.). . Шунынъ ичюн биз С26 керамиди специфик ЭРЭС-ке багълы олгъан акъсиллернинъ кластерлешмесини къолайлаштырмакъ ёлунен айырув ве таснифни идаре эте, деп теклиф этемиз.
Бу С26 керамидке багълы кластерлешювге белли бир ЭР мейданына насыл иришмек мумкюн? Мембраналы керамиднинъ ян тарафтан айырылув тенденциясы ГПИ-АП ве С26 керамидининъ теркибинде даа къыскъа ве тоюнмагъан глицеролипидлер олгъан ЭР мембранасынынъ даа тертипсиз липид муитинде кичик ве бир аньде тертиптеки липидлернинъ пейда олувына себеп ола биле. Кефильлик кластерлери (17, 18). Бу кичик мувакъкъат джыйынтыкълар р24 комплексине багълангъан сонъ, даа буюк, даа тургъун джыйынтыкъларгъа къошулмакъ мумкюн (34). Бунъа мувафыкъ оларакъ, биз С26 Gas1-GFP p24 комплексинен тесирлешип, даа буюк корюнген кластерлерни мейдангъа кетирмек кереклигини косьтере эдик (3 рес.). р24 комплекси маядаки дёрт чешит р24 трансмембраналы акъикъатларындан ибарет олгъан гетерозигот олигомердир (35), о чокъ дегерли багъланувны теминлей, бу исе кичик ГПИ-АП кластерлерининъ хачлы багъланувына кетире биле, ве бунынънен даа буюк Стабиль кластер пейда ола (34). ГПИ-АП-лернинъ акъсил эктодоменлери арасындаки тесирлешюв оларнынъ агрегациясына да ярдым эте биле, буны оларны махлюкъларнынъ полярлашкъан эпителий укюретлеринде Гольджи ташув вакътында косьтере (36). Лякин ЭР зарында С18-С16 керамиди олгъанда, р24 комплекси Gas1-GFP-ге багълангъанда, буюк айры кластерлер пейда олмайджакъ. Эсас механизм узун ацил зынджырлы керамиднинъ специфик физик ве химиявий хусусиетлерине багълы ола биле. Суний зарларнынъ биофизик теткъикъатлары шуны косьтере ки, эм узун (С24), эм де къыскъа (С18-С16) ацил зынджырлы керамидлер фаза айырылмасына себеп ола бильселер де, тек узун ацил зынджырлы керамидлер (С24) пленканынъ шекилини янъыдан шекиллендирмек ичюн юксек Эгриликке ве пленканынъ букюльмесине ярдым эте билелер. Къаршылыкълы мураджаат ярдымынен (17, 37, 38). Эмп24нинъ инсан гомологы олгъан ТМЭД2нинъ трансмембраналы сарпысы цитоплазма лобуляларында С18 керамид эсасында сфингомиелиннен сечип алув ёлунен тесирлешкени косьтерильди (39). Молекуляр динамика (МД) импульслерини къулланып, биз эм С18, эм де С26 керамидлери Emp24 трансмембраналы сарпынынъ цитоплазма лобулялары этрафында топлангъаныны ве оларнынъ сечимлери бир-бирине бенъзегенини таптыкъ (S6 рес.). Бу, Emp24 трансмембраналы спирали липидлернинъ мембранада асимметрик пайлашувына кетире биледжегини косьтере, деп къайд этмек керек. Бу якъында махлюкъларнынъ укюретлерине эсаслангъан нетиджедир. Бунъа бенъзеген МД импульслери де эфир липидлерининъ олгъаныны косьтере (40) . Онынъ ичюн биз ЭР26-нынъ эки лобуласындаки С26 керамиди ерли зенгинлешкенини тахмин этемиз. Луминаль лобулялардаки ГПИ-АП догърудан-догъру чокъ дегерли р24-ке багълангъанда ве цитоплазма лобуляларында р24 этрафында С26 керамидининъ топланувына ярдым эте биле. ЭР зарнынъ регионлары (42). Эвельки рапортларда теклиф этильген механизм тасдикълангъан эди (43, 44). Олиголектинлернинъ, патогенлернинъ я да антителоларнынъ керамид эсасындаки гликосфинголипидлерге (ГСЛ) плазма зарында чокъ дегерли багъланмасы ГСЛнинъ буюк агрегациясыны къозгъай, фазаларнынъ айырылувыны къуветлештире ве зарнынъ деформациясына ве интернализациясына себеп ола (44). Ивабучи ве иляхре (43) Узюн (С24), амма къыскъа дегиль (С16) ацил зынджырлары олгъанда, ГСЛ лактозилцерамидке багълы чокъ дегерли коганд буюк кластерлернинъ пейда олувыны ве мембраналы инвагинацияны индюкация эте, цитоплазмаларда исе Лин вастасынен нейгитил листовкалар устюнде нейтроплазма ярдымынен сигнал трансдукциясы акциллер арасында олгъаны тапылды.
Сют эмиджилернинъ полярлашкъан эпителий укюретлеринде анти-Гольджи агъынынъ (ТГН) апикаль плазма зарынынъ севиесине концентрациясы ГПИ-АП-нинъ айырылувыны ве сыраланувыны идаре эте (10, 45). Бу агрегация ГПИ-АП олигомеризациясынен идаре этиле (36), амма о, биз маяда расткетирген керамид зынджырынынъ узунлыгъына да багълы ола биле. Сют эмиджилернинъ ГПИ-АП эфир липидлери эсасында анкерге малик олса да, онынъ химиявий къурулышы пек узун ацил зынджырлы керамидтен пек фаркълы олса да, якъында япылгъан бир араштырмада эки липиднинъ де эволюцион джеэттен бенъзеген физик ве химиявий хусусиетлери Ве функциясы тапылды (40). Демек, махлюкъларнынъ укюретлериндеки эфир липид къысмы маядаки С26 керамидине бенъзей биле, онынъ ролю исе ГПИ-АП агрегациясына ве сыраланувына ярдым этмек ичюн зардаки узун зынджырлы керамиднен багъланмакътыр. Бу имкянны даа догърудан-догъру сынамакъ керек олса да, эвельки тапмаджалар узун ацил зынджырлы керамиднинъ Гольджи тенине ташылмасы цитоплазма кочюрильме акъикъатлары тарафындан япылмагъаныны, амма мая киби ГПИ анкерлерининъ синтезине багълы олгъаныны тасдикълай. Демек, эволюцион консерватив механизм, корюне ки, пек узун ацил зынджырлы керамид ве ГПИ-АП (13, 16, 20, 46, 47) бир ташув пузырьинде сечип алув ёлунен бирликте ташып ола.
Мая ве махлюкъларнынъ полярлашкъан эпителий ульке системаларында ГПИ-АП агрегациясы ве дигер плазма зар акъикъатларындан айырылув эписи ульке юзюне етмезден эвель олып кече. Паладино ве башкъалар. (48) таптылар ки, махлюкъларнынъ полярлашкъан эпителий укюретлерининъ ТГН-инде ГПИ-АП кластерлешмеси тек ГПИ-АП-лернинъ апикаль плазма зарына селектив таснифи ичюн керек дегиль, амма ГПИ-АП-лернинъ кластерлешюв тешкилятыны ве Онынъ биологик фаалиетини де низамлай. Уджейренинъ юзю. Маяда бу чалышма ЭР устюндеки С26 керамидке багълы ГПИ-АП кластери плазма зарындаки ГПИ-АПнынъ кластер тешкилятыны ве функциональ фаалиетини низамлай биледжегини косьтере (24, 49). Бу моделге мувафыкъ оларакъ, GhLag1 улькелери ГПИ ингибиторларына я да ульке диварынынъ бутюнлигине тесир этеджек иляджларгъа аллергиягъа маликлер (28), мая улькелерининъ чыкъышында проекциялангъан удж керамидининъ функциональ Gas1-GFP кластерлерине (49) олгъан ихтиядж G hLa улькесининъ ола бильген физиологик нетиджелерини косьтере. ГПИ-АП хата. Лякин липидлернинъ узунлыгъына эсаслангъан сыралав усулы иле ЭР-ден ульке юзюнинъ функциональ тешкиляты программалангъаныны илериде тешкермек бизим келеджек араштырмаларымызнынъ мевзусы оладжакъ.
Бу иште къулланылгъан Saccharomyces cerevisiae штаммлары S1 джедвельде берильген. W303 фонунда джанлы улькелерни тасвир этмек ичюн SCLIMнинъ MMY1583 ве MMY1635 штаммлары къурулды. Флюоресцент бель бирлеми олгъан Sec13-mCherry экспрессиясы олгъан бу штаммлар шаблон оларакъ pFA6a плазмидасы олгъан полимераз зынджырлы реакция (ПЗР) эсасында усул къулланып къурулды (23). GAL1 промоторынынъ незарети алтында флюоресцент акъсилнен бельгиленген Mid2-iRFP экспрессиясы олгъан штамм бойле къурулды. pKTiRFP-KAN векторындан iRFP-KanMx сырасынынъ ПЦР амплифика-циясы (Э. О’Шининъ бахшышы, Addgene плазмидасынынъ номерасы 64687; http://n2t.net/addgene: 64687; араштырма ресурсынынъ идентификаторы (RRID): Addgene_64687 the Cndogen Mid2-iRFP геном сырасы амплифика-циялангъан сонъ ве GAL1 промоторына клонлангъан сонъ, о, pRS306 интеграция плазмидасынынъ Not I-Sac I ерине интеграцияланды. Алынгъан pRGS7 плазмидасы Pst I иле URA3 локусына интеграцияланмакъ ичюн сызыкълылаштырылды.
Gas1-GFP синтез гени центромер (CEN) плазмидасында GAL1 промоторынынъ незарети алтында ифаделене, о бойле къурулгъан. Gas1-GFP сырасы pRS416-GAS1-GFP плазмидасындан (24) (Л. Пополонынъ бахшышы) ПЦР ёлунен амплификация этильди ве CEN плазмидасы pBEVY-GL LEU2 (С бахшышы) Xma I–Xho I ерине клонланды . Миллернинъ; Адген плазмидасынынъ ракъамлы 51225; http://н2т.нет/къошма: 51225; РРИД: Къошма_51225). Алынгъан плазмидагъа pRGS6 адыны къойдылар. Axl2-GFP синтез гени де pBEVY-GL LEU2 векторынынъ GAL1 промоторынынъ незарети алтында ифаделене ве онынъ къурулышы бойледир. Axl2-GFP сырасы pRS304-p2HSE-Axl2-GFP плазмидасындан (23) ПЦР ёлунен амплификация этильди, ве pBEVY-GL LEU2 векторынынъ Bam HI-Pst I ерине клонланды. Алынгъан плазмидагъа pRGS12 адыны къойдылар. Бу чалышмада къулланылгъан олигонуклеотидлернинъ сырасы S2 джедвельде берильген.
Штаммгъа 0,2% аденин ве 2% глюкоза [YP-декстроза (YPD)], 2% рафиноза [YP-рафиноза] зенгин мая экстракты акъ p (YP) ортасы (1 % Мая экстракты ве 2% акъ эпт) къошулды. (YPR)] я да 2% галактоза [YP-галактоза (YPG)] углерод менбасы оларакъ, я да синтетик минималь муитте (0,15% мая азот базасы ве 0,5% аммиак сульфаты) гъыдаланув ичюн керек олгъан уйгъун аминокислота ве негизлерни толдурмакъ ичюн , Ве теркибинде 2% синтетик глюкоза2 я да ( (синтетик галактоза минималь муити) углерод менбасы оларакъ къулланыла.
Реаль вакъытта тасвир этмек ичюн GAL1 промоторы алтында конструкцияны ифаделеген араретке сезимли sec31-1 мутант улькелери 24°С температурада YPR муитинде гедже девамында орта лог фазасына къадар осьтюрильди. 24°С температурада 1 саат девамында ЙПГ-де индукция япылгъан сонъ, улькелерни 37°С температурада СГ-де 30 дакъкъа девамында инкубация этелер, сонъра секреция блогындан чыкъармакъ ичюн 24°С-ке кечирелер. Конканавалин А ярдымынен улькелерни джам слайдкъа пекиттилер ве SCLIM ярдымынен тасвир эттилер. SCLIM – бу Olympus IX-71 терс флюоресцент микроскопы ве UPlanSApo’ 100×1,4 ракъамлы диафрагмалы ягълы линза (Olympus), юксек сурьатлы ве юксек сигнал-шум нисбетинде айлангъан диск конфокаль сканер (Yokogawa Electric), махсус спектрометр системасы (Yokogawa Electric), махсус спектрометрнинъ комбинациясыдыр. («Хамамацу Фотоника») сонъки буюклештирюв ×266,7 олгъан буюклештирюв линза системасыны ве электронларны арттыргъан зарядлы къошулгъан алет камерасыны («Хамамацу Фотоника») темин эте биле (21). Образларны алув махсус программа (Yokogawa Electric) ярдымынен япыла. 3D тасвирлер ичюн биз объективнинъ линзасыны вертикаль шекильде титретмек ичюн махсус япылгъан пьезоэлектрик арекетке кетирювджини къулландыкъ ве оптик къысымларны бири-биринден 100 нм узакълыкъта бир стекагъа топладыкъ. Z-стек тасвири 3D воксел малюматларына чевириле, айланув диск конфокаль микроскопы ичюн къулланылгъан назарий нокъта яйылув функциясы исе Volocity программасы (PerkinElmer) ярдымынен деконволюция ишлемеси ичюн къулланыла. Volocity программасыны къулланып, бир ерлешюв талили ичюн автоматик босагъа япмакъ ичюн, юкни де къошып, ЭРЭС ольченильди. Сызыкълы сканер талили MetaMorph программасы (Molecular Devices) ярдымынен япылды.
Статистик эмиетини бельгилемек ичюн GraphPad Prism программасыны къулланынъыз. Эки къуйрукълы Студентнинъ t-тести ве адий бир тарафлы дисперсия талили (АНОВА) тести ичюн группалар арасындаки фаркълар Р <0,05 (*) ольчюсине эмиетли тесир эте, деп сайыла.
Gas1-GFP флюоресцент микроскопиясы ичюн лог фазалы улькелерни гедже девамында YPD-де осьтюрдилер ве центрифуга ёлунен топладылар, фосфат буферли физиологик ернен эки кере ювдылар ве буз устюнде энъ аздан 15 дакъкъа инкубация эттилер, сонъра исе микроскоп астында эвельден тасвирленгени киби яптылар (24). Алув ичюн объектив линзасы, L5 (GFP) фильтри, Hamamatsu камерасы ве Application Suite X (LAS X) программасынен донатылгъан Leica DMi8 микроскопы (HCX PL APO 1003/1.40 ягълы PH3 CS) къулланылды. .
Пробалар 65°С температурада 10 дакъкъа девамында SDS проба буфери иле денатурирленди, сонъра SDS-полиакриламид гель электрофорези (PAGE) ярдымынен айырылды. Иммуноблоттинг анализи ичюн бир ёлакъкъа 10 мкл нумюне юкленди. Биринджи антитело: 1:3000 ольчюде тавшан поликлональ анти-Gas1, 1:500 ольчюде тавшан поликлональ анти-Emp24 ве 1:300 ольчюде тавшан поликлональ анти-GFP (Х. Ризманнынъ бахшышы) къулланынъыз. Сычан моноклональ анти-Pgk1 антителосы 1:5000 ольчюде иритильгенде къулланылды (Х. де ла Крузнынъ бахшышы). Экинджи антитело: 1:3000 ольчюде иритильгенде къулланылгъан хрен пероксидазасы (ХРП) конъюгированный эчки анти-тавшан иммуноглобулин G (IgG) (Пирс). ГРП-конъюгированный эчки анти-сычан IgG 1:3000 ольчюде иритильгенде къулланылды (Пирс). Иммун джевап зонасы SuperSignal West Pico реактивининъ (Thermo Fisher Scientific) химилюминесценция усулы иле козетильди.
(31) рес-де тасвирленгени киби, зенгинлештирильген ЭР фракциясы узеринде табиий иммунопреципитация эксперименти япылды. Къыскъадан айткъанда, мая улькелерини ТНЭ буферинен [50 мМ трис-НСl (рН 7,5), 150 мМ NaCl, 5 мМ ЭДТА, 1 мМ фенилметилсульфонилфторид ве протеаза ингибиторы къарышмасынен) 600 нм ( OD600) температурада 100 опт. Оны джам боюнджакъларынен сындырдылар, сонъра исе ульке къалдыкъларыны ве джам боюнджакъларыны центрифуга ярдымынен чыкъардылар. Сонъра супернатантны 17 000 г температурада 4°С температурада 15 дакъкъа девамында центрифугагъа къойдылар. Пеллетни ТНЭ-де гъайрыдан суспензия этелер ве digitalis сапонинини 1% сонъки концентрациягъа къадар къошалар. Суспензияны 4°С температурада айландырувнен 1 саат инкубация этелер, сонъра иримейджек компонентлерни 13 000 г 4°С температурада 60 дакъкъа девамында центрифуга ярдымынен чыкъаралар. Gas1-GFP иммунопреципитациясы ичюн башта нумюнени бош агароза боюнджакъларынен (ChromoTek) 4°С температурада 1 саат эвельден инкубация этмек керек, сонъра исе GFP-Trap_A (ChromoTek) иле 4°С температурада 3 саат девамында инкубация этмек керек. Иммунопреципитациялангъан боюнджакълар 0,2% дигоксигенин олгъан ТНЭ иле беш кере ювулды, SDS нумюне буфери иле элюирленди, SDS-PAGE устюнде айырылды ве иммуноблоттинг ёлунен талиль этильди.
(31) рес-де тасвирленгени киби, зенгинлештирильген ЭР фракциясы узеринде хачлы багъланувны бельгилемек япылды. Къыскъадан айткъанда, зенгинлештирильген ЭР фракциясы 0,5 мМ дитиобис(сукцинимидилпропионат) (Пирс, Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, USA; 20°С, 20 дакъ.) иле инкубация этильди. Силька реакциясы глицин къошып сёндюрильди (50 мМ сонъки концентрация, 5 дакъкъа, 20°С).
Эвельден тасвирленгени киби (50), кийик типли ве GhLag1 штаммларында керамиднинъ МС анализи япылды. Къыскъадан айткъанда, 30°С температурада ЙПД-де улькелерни экспоненциаль фазагъа (3-тен 4-кедже ОД600 бирлик/мл) осьтюрдилер ве 25×107 ульке джыйдылар. Оларнынъ метаболизми трихлорсирке экшилигинен сёне. Экстракция иритиджиси [этанол, сув, эфир, пиридин ве 4,2 н аммоний гидроксиди (15:15:5:1:0,018 об/об)] ве 1,2 нмоль ички стандарт С17 керамиди (860517, Avanti поляр липид) кейфиетини къулланынъыз. Экстрактнынъ енгиль сиркели гидролизини япмакъ ичюн монометиламин реактивини [метанол, сув, н-бутанол ве метиламин иляджы (4:3:1:5 об/об)] къулланынъыз, сонъра сувнен тоюндырылгъан н-бутанолны тузсызландырмакъ ичюн къулланынъыз. Ниает, экстракт мусбет режимли иритиджиде [хлороформ/метанол/сув (2:7:1) + 5 мМ аммоний ацетат] гъайрыдан суспензияланды ве масса спектрометрине инъекция этильди. Сфинголипид молекулаларыны айырды этмек ве оларнынъ микъдарыны бельгилемек ичюн чокъ реакциялы мониторинг (ЧРМ) япылды. TSQ Vantage учюнджи дереджели квадрупольли масса спектрометри (Thermo Fisher Scientific) липидлернинъ талили ичюн роботлаштырылгъан наноакъымлы ион менбасы Nanomate HD (Advion Biosciences, Итака, Нью-Йорк штаты) иле донатылгъан. Чатышма энергиясы эр бир керамид категориясы ичюн оптималлаштырыла. МС малюматлары мусбет режимде эльде этильди. Эр бир биологик репликация ичюн липид сигналы учь мустакъиль ольчюнинъ орталамасыдыр.
(31) рес-де тасвирленгени киби, Gas1-GFP экспрессиясы олгъан улькелер (800×107) табиий иммунопреципитациягъа огъратылды. Темизленген Gas1-GFP SDS-PAGE ярдымынен айырылды ве поливинилиденфторид (ПВДФ) мембранасы устюне кечирильди. Акъсиллерни ПВДФ-ни амид къара боялав ёлунен корьгездилер. ПВДФ-ден Gas1-GFP лентасы кесильди ве 5 кере метанолнен, бир кере исе сувлу хроматография-МС (ЖХ-МС) сыныфлы сувнен ювулды. Мембраналы лентаны 500 мкл 0,3 М NaOAc (рН 4,0), буфер ве 500 мкл тазе эритильген 1 М натрий нитрит къарышмасынен 37°С температурада 3 саат девамында инкубация этип, липид фракциясы Gas1-GFP ве лизленген инофазин арасында чыкъарыла. (51) ола. Бундан сонъ мембраналы лентаны дёрт кере ЖК-МС сыныфлы сувнен ювып, ода араретинде къуруттылар ве анализ япылгъандже -80°С азот атмосферасында сакъладылар. Незарет оларакъ эр бир теджрибе ичюн ПВДФ мембранасынынъ бош нумюнеси къулланылды. Сонъра Gas1-GFP-ден чыкъарылгъан липидни МС ярдымынен тасвирленгени киби талиль эттилер (50). Къыскъадан айткъанда, теркибинде ГПИ-липид олгъан ПВДФ ленталары 75 мкл менфий къалып иритиджисинде [хлороформ/метанол (1:2) + 5 мМ аммоний ацетат] гъайрыдан суспензияланды ве электроспрей ионизациясы (ЭСИ)-Сфинголипид тюрлерининъ МРМ/МС анализинден кечти (TSQ Vantage). Бу вазиетте МС малюматлары менфий ион режиминде эльде этильди.
Юкъарыда къайд этильгени киби, ГПИ анкерининъ липид къысмы [3Н]-инозитолнен бельгиленген ГПИ-АП-тен айырылды (16). Липидлер иритиджи системасы (55:45:10 хлороформ-метанол-0,25% KCl) ярдымынен индже къатламлы хроматография ярдымынен айырылды ве FLA-7000 (Fujifilm) ярдымынен корюнтиленди.
Gas1-GFP (600×107) экспрессиясы олгъан улькелерни ТНЭ буфери олгъан ТНЭ буферинен эки кере ювдылар, ве джам боюнджакъларынен сындырдылар, сонъра ульке къалдыкъларыны ве джам боюнджакъларыны чыкъармакъ ичюн центрифугагъа къойдылар. Сонъра супернатантны 17 000 г температурада 4°С температурада 1 саат девамында центрифугагъа къойдылар. Пеллетни ТНЭ-де ювдылар ве 37°С температурада 1 саат девамында 0,2% digitalis сапонини олгъан ТНЭ-де 1 U PI-PLC (Invitrogen) иле инкубация эттилер. Ферментлернен ишленген сонъ, 4°С температурада 1 саат девамында 17 000 г центрифуга ярдымынен мембрананы чыкъардылар. Gas1-GFP иммунопреципитациясы ичюн супернатантны GFP-Trap_A (ChromoTek) иле 4°С температурада гедже инкубация этелер. SDS-PAGE иле айырылгъан темизленген Gas1-GFP Кумасси парлакъ мавысынен бояланды. Gas1-GFP боялав лентасы акведукны сарып алгъан боздан кесильди, сонъра йодацетамиднен алкилленген сонъ ве дитиотреитолнен редукциялангъан сонъ, трипсиннен гель ичинде азырлав япылды. ГПИ-гликанларнен триптик пептидлерни ве пептидлерни чыкъарып къурутынъыз. Къуругъан пептидни 20 мкл сувда ириттилер. ЛК-ге бир къысмыны (8мкл) инъекция этинъиз. Пептидлерни белли бир градиент шараитлеринде айырмакъ ичюн октадецилсилан (ОДС) колонкасы (Develosil 300ODS-HG-5; ички диаметри 150 мм×1,0 мм; Nomura Chemical, Айти префектурасы, Япония) къулланылды. Кочьме фаза — А иритиджиси (0,08% мурджие экшилиги) ве В иритиджиси (80% атсетонитрильде 0,15% мурджие экшилиги). Accela ВЭЖХ системасы (Thermo Fisher Scientific, Boston, Massachusetts) ярдымынен колонканы 55 дакъкъа ичинде А иритиджисинен 50 мкл мин-1 акъынты тезлигинен 5 дакъкъа девамында элюирледилер, сонъра В иритиджисининъ концентрациясыны 40%-ке къадар арттырдылар. , АКъШ). Элюат ЭСИ ион менбасына токътамайып кирсетильди, триптик пептидлер ве ГПИ-гликанлы пептидлер LTQ Orbitrap XL (гибрид сызыкълы ион тузакъ-орбитрап масса спектрометри; Thermo Fisher Scientific) ярдымынен талиль этильди. МС ерлештирювинде капилляр менбасынынъ кергинлиги 4,5 кВ-гъа къоюлды, кочюрильме капиллярнынъ арарети исе 300°С-те тутулды. Капилляр кергинлиги ве лампа линзасы кергинлиги 15 В ве 50 В оларакъ къоюлды. МС малюматлары мусбет ион режиминде (60 000 чешитлиги; масса догърулыгъы миллионда 10 къысым) 300/м/з масса/заряды нисбети (м/з) 3000 масса диапазонында эльде этильди. чарпышмадан пейда олгъан диссоциация (ЧДД)].
МД импульслери GROMACS (52) программасы ве MARTINI 2 кучь мейданчыгъы (53-55) ярдымынен япылды. Сонъра CHARMM GUI Membrane Builder (56, 57) ярдымынен диолеоилфосфатидилхолин (DOPC) ве Cer C18 я да DOPC ве Cer C26 олгъан эки къатлы къурулды. Cer C26 топологиясы ве координаталары сфингозин къуйругъындан зияде боюнджакъларны чыкъарып, DXCE-ден алынгъан. Эки къатламны мувазене этмек ве оны чалыштырмакъ ичюн ашагъыда тасвирленген джерьянны къулланынъыз, сонъра системанынъ сонъки координаталарындан файдаланып, Emp24 олгъан системаны къурунъ. Emp24 маясынынъ трансмембраналы домени (173-тен 193-кедже къалымтылар) корюнтили МД (ВМД) алетининъ молекуляр къурулышыны къулланып α-сарп шеклинде къурулды (58). Сонъра, бири-бирине къаплангъан липидлерни чыкъаргъан сонъ, акъсилни къаба грануляция этип, CHARMM GUI ярдымынен эки къатлы ичине кирсеттилер. Сонъки системада 1202 ДОПК ве 302 Цер С26 я да 1197 ДОПК ве 295 Цер С18 ве Эмп24 бар. Системанынъ 0,150 М концентрациясына къадар ионлаштырынъыз. Эки эки къатлы композиция ичюн дёрт мустакъиль текрарлав япылды.
Липид эки къатлылыгъы CHARMM GUI джерьяны ярдымынен мувазене этиле, бу джерьян 405 бинъ адымны минимальлештирмек ве сонъра мувазене этмекни козьде тута, мында ерлешюв сынъырлары яваш-яваш эксиле ве ёкъ этиле, вакъыт адымы исе 0,005 пс-тен 0,02 пс-ке къадар арттырыла. Мувазенеге кетирильген сонъ, о, 0,02 пс вакъыт адымы олгъан 6 мкс чыкъара. Emp24 кирсетильген сонъ, системаны энъ эксик дереджеге еткизмек ве мувазене этмек ичюн айны CHARMM GUI джерьяныны къулланынъыз, сонъра исе 8 с девамында истисалда чалышынъыз.
Бутюн системалар ичюн баланслаштырув джерьянында басымны Берендсен баростаты (59), истисал джерьянында исе басымны Парринелло-Рахман баростаты (60) идаре эте. Эписи алларда орта басым 1 бар ве ярым изотроп басым муфталаштырув схемасы къулланыла. Баланс ве истисал джерьянында сырасынен акъсиллернинъ, липидлернинъ ве иритиджи парчачыкъларнынъ араретини бирлештирмек ичюн сурьатны гъайрыдан калибрлемек ичюн термостат (61) къулланыла. Бутюн амелият девамында макъсадлы арарет 310К ола. Багъланмагъан тесирлешюв 0,005 буфер толерантлыгъы олгъан Верле схемасыны къулланып, чифтлешюв джедвелини мейдангъа кетирюв ёлунен эсаплана. Кулон термини реакция мейданындан ве 1,1 нм кесюв месафесинден файдаланып эсаплана. Вандер Ваалс термининде кесюв месафеси 1,1 нм олгъан кесюв схемасы къулланыла, потенциаль дрейф ичюн исе Верленинъ кесюв схемасы къулланыла (62).
ВМД къулланып, ДОПК фосфат боюнджакълары я да керамид АМ1 боюнджакълары ве акъсиллер арасындаки кесюв далгъа узунлыгъы 0,7 нм тешкиль эте ве акъсиллернен тесирлешкен липидлернинъ сайысы эсаплана. Ашагъыдаки формулагъа коре (63) рес-деки киби эксильтюв-зенгинлештирюв (ДЗ) коэффициентини эсапла: ДЭ коэффициенти = (акъсилдеки умумий липидлернинъ микъдары 0,7) акъсилдеки 0,7 (умумий липидлердеки Цернинъ микъдары) .
Хабер этильген къыймет орталама оларакъ эльде этиле, хата сызакълары исе СЕнинъ дёрт мустакъиль копиясыдыр. ДЭ факторынынъ статистик эмиети t тести [(ортаДЭ-фактор-1)/СЕ] ярдымынен эсаплана. Бир къуйрукълы пайлаштырмадан Р къыйметини эсапла.
GROMACS алети ярдымынен изнинъ сонъки 250 нс ичинде Emp24 олгъан системанынъ 2D ян сыкълыкъ харитасыны эсапладылар. Керамиднинъ зенгинлешюв/эксильюв харитасыны алмакъ ичюн, Цернинъ сыкълыкъ харитасыны Цер ве ДОПК харитасынынъ джемисине болелер, сонъра исе Цернинъ организмдеки концентрациясына болелер. Айны ренкли харита ольчюси къулланыла.
Бу макъаленинъ къошма материалларыны http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/50/eaba8237/DC1 адресинден алмакъ мумкюн.
Бу Creative Commons Attribution-Non-Commercial License шартларына коре даркъалгъан ачыкъ иришильген макъаледир, о, эр бир муитте къулланмагъа, даркъатмагъа ве чокълаштырмагъа имкян бере, тек сонъки къулланув тиджарет къазанчы ичюн олмаса ве премема асыл эсернинъ догъру олгъаны олса. Атыф.
Ишарет: Биз тек сизден почта адресинъизни бермеге риджа этемиз, сиз саифеге тевсие этеджек адам сиз почтаны корьмеге истегенинъизни ве бу спам олмагъаныны бильсин. Биз ич бир почта адресини запт этмейджемиз.
Бу суаль сизнинъ мусафир олгъанынъызны тешкермек ве автоматик спам ёлланмасынынъ огюне кечмек ичюн къулланыла.
София Родригес-Галлардо, Казуо Курокава, Сусана Сабидо-Босо, Алехандро Кортес · Гомес (Алехандро Кортес-Гомес), Ацуко Икеда (Ацуко Икеда), Валерия Зони (Валерия Зони), Ауксилиадора Агилера-Ромеро, Ана Мария Перес Лохихопе -Линеро (Линеро), Вага), Мисако Арман (Мисако Арман), Мияко Риман (Мияко Риман), Проу Акира, Стефано Фанни, Акихико Накано, Мануэль Мунис
3D юксек ифаделиликтеки акъикъий вакъытта тасвирлев селектив чыкъыш ерлеринде акъсиллерни сыралав ичюн керамид зынджырынынъ узунлыгъынынъ эмиетини ачыкълай.
София Родригес-Галлардо, Казуо Курокава, Сусана Сабидо-Босо, Алехандро Кортес · Гомес (Алехандро Кортес-Гомес), Ацуко Икеда (Ацуко Икеда), Валерия Зони (Валерия Зони), Ауксилиадора Агилера-Ромеро, Ана Мария Перес Лохихопе -Линеро (Линеро), Вага), Мисако Арман (Мисако Арман), Мияко Риман (Мияко Риман), Проу Акира, Стефано Фанни, Акихико Накано, Мануэль Мунис
3D юксек ифаделиликтеки акъикъий вакъытта тасвирлев селектив чыкъыш ерлеринде акъсиллерни сыралав ичюн керамид зынджырынынъ узунлыгъынынъ эмиетини ачыкълай.
©2020 Илимнинъ илерилеви ичюн Америка бирлешмеси. бутюн акълар сакълангъан. АААС - ХИНАРИ, АГОРА, ОАРЕ, ХОР, КЛОКСС, КроссРеф ве САЙЧЫКЪнынъ шериклеридир. Илимнинъ илерилеви ISSN 2375-2548.