Макъале «Богъдай осюмликлерининъ хасталыкъ кетирген ве зарарлы осюмликлерге къаршы турувыны юксельтюв» араштырма мевзусынынъ бир къысмыдыр, 5 макъаленинъ эписини бакъынъыз
Мантар осюмлик хасталыгъынынъ некрозынынъ себепчиси Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary чешит эв саиби осюмликлерни зарарламакъ ичюн чокъ къатлы стратегия къуллана. Бу чалышмада Phaseolus vulgaris L. махлюкъынынъ Pseudootioler тарафындан пейда олгъан беяз куфке къаршы молекуляр, физиологик ве биохимик джевапларыны къуветлештирмек ичюн альтернатив идаре стратегиясы оларакъ диамин L-орнитинни, дигер зарур аминокислоталарнынъ синтезини тешвикъат этеджек акъсилсиз аминокислотасыны къулланмакъ теклиф этиле. In vitro теджрибелери L-орнитин S. pyrenoidosa мицелийининъ осьмесини дозагъа багълы шекильде эмиетли дереджеде ингибирлегенини косьтере. Бундан да гъайры, о, теплица шараитлеринде беяз куфнинъ агъырлыгъыны сезилерли дереджеде эксильте биле эди. Бундан да гъайры, L-орнитин ишленген осюмликлернинъ осьмесини тешвикъ эте, бу исе L-орнитиннинъ сынавдан кечирильген концентрациялары ишленген осюмликлер ичюн фитотоксик олмагъаныны косьтере. Бундан гъайры, L-орнитин ферментсиз антиоксидантларнынъ (умумий ириген феноликлер ве флавоноидлернинъ) ве ферментли антиоксидантларнынъ (каталаза (КАТ), пероксидаза (ПОХ), ве полифенол оксидаза (ППО)) экспрессиясыны къуветлештирди, антиоксидантларнен багълы учь геннинъ (ПГРвД, ве ПВСОТ) экспрессиясыны арттырды. Бундан гъайры, in silico анализинде S. sclerotiorum геномында тахмин этильген оксалоацетат атсетилгидролаза (SsOAH) акъикъынынъ барлыгъы тапылды, бу акъикъ Aspergillum spensijiiHOAH ве PenensijiiHOAH филюсларнынъ оксалоацетат атсетилгидролаза (SsOAH) акъикъларына пек бенъзей эди. (PlOAH) функциональ талиль, консерватив доменлер ве топология джеэттен тасвирлене. Меракълысы шунда ки, къартоп декстроза бульоны (КДБ) муитине L-орнитин къошулгъанда, S. sclerotiorum мицелийлеринде SsOAH генининъ экспрессиясы эп эксильди. Айны шекильде, L-орнитиннинъ экзоген къулланылувы ишленген осюмликлерден топлангъан мантар мицелийлеринде SsOAH генининъ экспрессиясыны эмиетли дереджеде эксильтти. Ниает, L-орнитин къулланув эм ПДБ ортасында, эм де зарарлангъан япракъларда оксалат кислотасы секрециясыны сезилерли дереджеде эксильтти. Нетиджеде, L-орнитин хасталангъан осюмликлернинъ мудафаа джевабыны къуветлештирмекнен бир сырада, редокс статусыны сакълап къалувда эсас роль ойнай. Бу чалышманынъ нетиджелери беяз куфке къаршы курешмек ве онынъ бакъла истисалына ве дигер осюмликлерге тесирини енгиллештирмек ичюн янъылыкъ, экологик джеэттен темиз усулларны ишлеп чыкъмагъа ярдым эте биле.
Некротроф мантар Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary тарафындан пейда олгъан беяз куф – бу йыкъыджы, махсулдарлыкъны эксильткен хасталыкътыр, о, дюнья бакъла (Phaseolus vulgaris L.) истисалында джиддий хавф догъура (Болтон ве башкъ., 2006). Sclerotinia sclerotiorum - топракътаки мантар осюмликлернинъ энъ къыйын хасталыкъ кетиргенлеринден биридир, онынъ 600-ден зияде осюмлик чешитлеринден ибарет кенъ эв саиби диапазоны бар ве эв саиби токъумаларыны специфик олмагъан шекильде тез мацерация этмек къабилиети бар (Лянг ве Роллинс, 2018). О, озь омюр девирининъ агъыр фазесини кече, топракъта «склеротия» деп адландырылгъан къара, къатты, урлукъкъа бенъзеген къурулышлар я да зарарлангъан осюмликлернинъ мицелийинде я да сап ичиндеки беяз, пуф осюмликлер шеклинде узун вакъыт девамында раатлыкъта къала ве хасталангъан осюмликлернинъ сап ичиндеки осьмюрлер шеклинде къала (2). S. sclerotiorum склерозия мейдангъа кетирмеге къабилиетлидир, бу исе онъа зарарлангъан тарлаларда узун вакъыт сагъ къалмагъа ве хасталыкъ вакътында сакъланып къалмагъа имкян бере (Schwartz ве башкъ., 2005). Склеротиялар гъыдалы мадделернен зенгиндирлер, топракъта узун вакъыт сакълана билелер ве сонъки инфекциялар ичюн биринджи инокуляция оларакъ хызмет этелер (Шварц ве башкъ., 2005). Мунасип шараитлерде склеротиялар осьелер ве авадаки споралар чыкъаралар, олар осюмликнинъ ер устюндеки бутюн къысымларыны, шу джумледен, амма тек чечеклерни, сапларны я да пытакъларны зарарлай билелер (Шварц ве башкъ., 2005).
Sclerotinia sclerotiorum озь эв саиби осюмликлерини зарарламакъ ичюн чокъ къатлы стратегия къуллана, бу исе склерознынъ осьмесинден башлап, симптомларнынъ инкишафына къадар бир сыра координациялангъан вакъиаларны къабул эте. Башта S. sclerotiorum апотеция деп адландырылгъан мантаргъа бенъзеген къурулышлардан асылып тургъан споралар (аскоспоралар деп адландырыла) чыкъара, олар авагъа чыкъып, зарарлангъан осюмлик къалдыкълары устюнде арекетсиз склеротияларгъа чевириле (Болтон ве башкъ., 2006). Сонъра мантар осюмликнинъ ульке диварынынъ рН-ини идаре этмек, ферментлернинъ парчаланувына ве токъумаларгъа инвазиягъа ярдым этмек, эв саиби осюмликнинъ оксидатив патлавыны бастырмакъ ичюн вирулентлик факторы олгъан оксалик кислотасыны чыкъара (Hegedus and Rimmer, 2005). Бу экшилик джерьяны осюмликнинъ ульке диварыны зайыфлата, мантар ульке диварыны парчалайыджы ферментлернинъ (МУДЭ) нормаль ве самимий чалышмасы ичюн эйи муит ярата, хасталыкъ кетирген махлюкъкъа физик манъзыльни енъмеге ве эв саиби токъумаларына кирмеге имкян бере (Марчиано ве башкъ., 1983). S. sclerotiorum ичине кирген сонъ, полигалактуроназа ве целлюлоза киби бир сыра КВДЭ чыкъара, олар онынъ зарарлангъан токъумаларда даркъалувыны къолайлаштыра ве токъума некрозына себеп ола. Лезияларнынъ ве гифа матларнынъ прогрессивлешмеси беяз куфнинъ хас аляметлерине кетире (Hegedus and Rimmer, 2005). Бу арада эв саиби осюмликлер патогеннен багълы молекуляр шекиллерни (ПАМФ) шекиллерни таныгъан рецепторлар (ПРР) вастасынен таныйлар ве сонъунда къорчалав джевапларыны фаальлештирген бир сыра сигнал вакъиаларыны къозгъайлар.
Он йыллар девамында хасталыкъларгъа къаршы куреш гъайретлерине бакъмадан, бакълада, башкъа тиджарет осюмликлеринде олгъаны киби, хасталыкъ кетирген шейнинъ къаршылыкъ косьтерюв, сагъ къалув ве уйгъунлашув къабилиети себебинден етерли къаршылыкълы джермплазманынъ эксиклиги къалмакъта. Бунынъ ичюн хасталыкъларны идаре этмек сонъ дередже къыйындыр ве медений амелиятлар, биологик идаре ве химиявий фунгицидлернинъ бирлешмесини къабул этмек ичюн интеграль, чокъ тарафлы стратегияны талап эте (О’Салливан ве башкъ., 2021). Беяз куфке къаршы химиявий куреш энъ самимийдир, чюнки фунгицидлерни догъру ве керек вакъытта къуллангъанда, хасталыкънынъ даркъалувыны семерели идаре эте, инфекциянынъ агъырлыгъыны эксильте ве махсулдарлыкъ джоюмларыны энъ эксик дереджеге еткизе биле. Лякин фунгицидлерни зияде къулланув ве оларгъа зияде ишанув S. sclerotiorum нинъ къаршылыкълы штаммларынынъ пейда олувына кетире ве макъсадлы олмагъан организмлерге, топракъ сагълыгъына, сув кейфиетине менфий тесир эте биле (Le Cointe ве башкъ., 2016; Ceresini ве башкъ., 2024). Шунынъ ичюн экологик джеэттен темиз альтернативалар тапмакъ энъ муим вазифеге чевирильди.
Путресцин, спермидин, спермин ве кадаверин киби полиаминлер (ПА) топракътаки осюмликлернинъ хасталыкъ кетиргенлерине къаршы перспективли альтернатива оларакъ хызмет эте билелер, ве бунынънен хавфлы химиявий фунгицидлернинъ къулланувыны бутюнлей я да къысмен эксильтелер (Nehela ве башкъ., 2024; Yi20 ве башкъ., 2 ). Юкъары осюмликлерде ПА бир чокъ физиологик джерьянларда иштирак этелер, шу джумледен, амма сынъырланмайып, улькенинъ болюнмеси, дифференциациясы ве абиотик ве биотик стресслерге джевап берювде (Киллини ве Нехела, 2020). Олар антиоксидантлар вазифесини беджере билелер, реактив оксиген тюрлерини (РОС) джыймагъа ярдым этелер, редокс гомеостазыны сакълайлар (Нехела ве Киллини, 2023), къорчалавнен багълы генлерни индукция этелер (Ромеро ве башкъ., 2018), чешит метаболизм ёлларыны низамлайлар (Нехела ве Киллини, 20). Киллини, 2019), системалы къазанылгъан къаршылыкъны (СКК) тешкиль этелер, ве осюмликлернинъ патогенлернинъ тесирлешювини низамлайлар (Нехела ве Киллини, 2020; Асия ве башкъ., 2022; Червониец, 2022). Шуны къайд этмек керек ки, ПА-ларнынъ осюмликлернинъ къорчаланувындаки специфик механизмлери ве роллери осюмликлернинъ чешитлерине, хасталыкъ кетирген организмлерге ве этраф муитнинъ шараитлерине коре денъише. Осюмликлерде энъ чокъ расткельген ПА зарур полиамин L-орнитинден биосинтез этиле (Киллини ве Нехела, 2020).
Л-орнитин осюмликлернинъ осьмесинде ве инкишафында чокъ роль ойнай. Меселя, эвельки араштырмалар пирничте (Oryza sativa) орнитин азотнынъ гъайрыдан ишленмесинен (Лю ве башкъ., 2018), пирничнинъ махсулдарлыгъы, кейфиети ве къокъусынен (Лю ве башкъ., 2020), сув стрессине джевап берювнен (Ян ве башкъ., 2000) багълы ола бильгенини косьтере эдилер. Бундан гъайры, L-орнитиннинъ экзоген къулланылувы шекер чювреги (Beta vulgaris) (Хусейн ве башкъ., 2019) къургъакълыкъкъа даянувыны эмиетли дереджеде арттырды ве согъанда (Allium Cepa) (Чавушогълу ве Чавушоǧдадиум1каршедюцлу, 2020) туз стрессини енгиллештирди. Роча ве башкъалар, 2012 с.). Абиотик стресслерден къорчаланувда L-орнитиннинъ потенциаль ролю онынъ ишленген осюмликлерде пролин топланувында иштирак этмесинен багълы ола биле. Меселя, пролин метаболизминен багълы генлер, меселя, орнитин дельта аминотрансфераза (дельта-ОАТ) ве пролиндегидрогеназа (ProDH1 ве ProDH2) генлери Nicotiana straenthamiana ве Arabidopsis thaliana махлюкъларыны эв саиби олмагъан Pse ве Мисор, 2012 сенеси). Дигер тарафтан, хасталыкъ кетиргенлернинъ осьмеси ичюн мантар орнитин декарбоксилаза (ОДК) керек (Сингх ве башкъ., 2020). Фузариум оксиспорум е нишанлы ОДК. шп. lycopersici генлернинъ эв саиби тарафындан индукциялангъан генлернинъ сустырылмасы (HIGS) вастасынен помидор осюмликлерининъ Fusarium wilt къаршылыгъыны эмиетли дереджеде арттырды (Singh ве башкъ., 2020). Лякин фитопатогенлер киби биотик стресслерге къаршы экзоген орнитин къулланувынынъ потенциаль ролю яхшы огренильмеген. Даа муим шей шунда ки, орнитиннинъ хасталыкъларгъа къаршы турувгъа ве онен багълы биохимик ве физиологик адиселерге тесири чокътан-чокъ огренильмеген алда къалмакъта.
Богъдай осюмликлерининъ S. sclerotiorum инфекциясынынъ муреккеплигини анъламакъ, идаренинъ семерели стратегияларыны ишлеп чыкъмакъ ичюн муимдир. Бу тедкъикъатта биз диамин L-орнитиннинъ богъдай осюмликлерининъ мудафаа механизмлерини ве Sclerotinia sclerotiorum инфекциясына къаршы турувыны къуветлештирювде эсас фактор оларакъ потенциаль ролюни бельгилемеге макъсат къойдыкъ. Биз бойле фараз этемиз ки, зарарлангъан осюмликлернинъ къорчалав джевапларыны къуветлештирмектен гъайры, L-орнитин де редокс статусыны сакълап къалувда эсас роль ойнай. Биз L-орнитиннинъ потенциаль тесирлери ферментли ве ферментсиз антиоксидант къорчалав механизмлерининъ низамланмасы ве мантар патогенлиги/вирулентлик факторлары ве оларнен багълы олгъан акъсиллернинъ къарышмасынен багълы олгъаныны теклиф этемиз. L-орнитиннинъ бу эки тарафлама функциональлиги оны беяз куфнинъ тесирини енгиллештирмек ве умумий богъдай осюмликлерининъ бу кучьлю мантар патогенине къаршы турувыны арттырмакъ ичюн тургъун стратегия ичюн перспективли намзетке чевире. Бу тедкъикъатнынъ нетиджелери беяз куфке къаршы курешмек ве онынъ богъдай урлукълары истисалына тесирини енгиллештирмек ичюн инновацион, экологик джеэттен темиз усулларны ишлеп чыкъувда ярдым эте биле.
Бу чалышмада эксперименталь материал оларакъ адий бакъланынъ сезимли тиджарет чешити Гиза 3 (Phaseolus vulgaris L. cv. Giza 3) къулланылды. Сагълам урлукъларны Мысырнынъ богъдай осюмликлери ильмий-тедкъикъат болюги, тарла осюмликлери ильмий-тедкъикъат институты (ФКИ), кой ходжалыгъы ильмий-тедкъикъат меркези (АРК) мераметликнен бердилер. Беш урлукъ теплица шараитлеринде (25 ± 2 °С, нисбий дымлылыкъ 75 ± 1%, 8 с ярыкъ/16 с къаранлыкъ) S. sclerotiorum иле зарарлангъан топракънен толдурылгъан пластик савутларгъа (ички диаметри 35 см, теренлиги 50 см) сачылды. Экильген сонъ 7–10 куньде (ДПС) фиданларны инджеледилер, эр бир чанакъта тек бир тюрлю оськен эки фидан ве учь толусынен кенишлеген япракъ къалды. Бутюн чанакълы осюмликлер эки афтадан бир кере суварылды ве берильген сой ичюн тевсие этильген ольчюде эр ай гъыдаландырылды.
L-орнитиндиаминнинъ ((+)-(S)-2,5-диаминопентаноин кислотасы оларакъ да белли; Sigma-Aldrich, Дармштадт, Алмания) 500 мг/л концентрациясыны азырламакъ ичюн башта 50 мг 100 мл стериль дистиллят сувда иритильди. Сонъра запас иляджны иритип, сонъки теджрибелерде къулландылар. Къыскъадан айткъанда, L-орнитиннинъ концентрацияларынынъ алты сериясы (12,5, 25, 50, 75, 100 ве 125 мг/л) in vitro сынавындан кечирильди. Бундан гъайры, менфий контроль оларакъ стериль дистиллят сув къулланылды (Мок) ве тиджарет фунгициди «Ризолекс-Т» 50% дымлангъан тоз (токлофос-метил 20% + тирам 30%; КЗ-Кафр Эль Заят Эль Захар Пестицидлер ве Химикатлар Компаниясы, Каф) мусбет незарет оларакъ. «Ризолекс-Т» тиджарет фунгициди беш концентрацияда (2, 4, 6, 8 ве 10 мг/л) in vitro сынавындан кечирильди.
Тиджарет ходжалыкъларындан беяз куфнинъ типик аляметлерини косьтерген умумий бакъла саплары ве пытакъларынынъ нумюнелери (инфекциянынъ ольчюси: 10–30%) топланды. Юкъунчлы осюмлик материалларынынъ чокъусы тюр/чешитке коре белли олса да (сезиджи тиджарет чешити Гиза 3), дигерлери, хусусан ерли базарлардан эльде этильгенлери белли олмагъан чешитлерден эди. Топлангъан зарарлангъан материаллар башта 3 дакъкъа девамында 0,5% натрий гипохлорит иляджынен юзюни дезинфекция эттилер, сонъра стериль дистиллят сувнен бир къач кере чайкъадылар ве артыкъ сувны чыкъармакъ ичюн стериль фильтр кягъытнен къуруттылар. Сонъра зарарлангъан мучелер орта токъумадан (сагълам ве зарарлангъан токъумалар арасында) кичик парчаларгъа кесильди, къартоп декстроза агар (КДА) ортасында осьтюрильди ве 25 ± 2 °С температурада 12 саат ярыкъ/12 саат къаранлыкъ девирде 5 кунь девамында инкубация этильди, бу исе склерозиянынъ пейда олувыны тешвикъат этти. Къарышыкъ я да кирли культуралардан мантар изолятларыны темизлемек ичюн де мицелий уджу усулы къулланылды. Темизленген мантар изоляты башта онынъ медений морфологик хусусиетлерине эсасланып белли этильди, сонъра микроскопик хусусиетлерине эсасланып S. sclerotiorum олгъаны тасдыкъланды. Ниает, бутюн темизленген изолятлар Кохнынъ постулатларына джевап бермек ичюн, сезимли умумий бакъла сою Giza 3 узеринде патогенликке коре сынавдан кечирильди.
Бундан гъайры, энъ инвазив S. sclerotiorum изоляты (изолят No3) White ве башкъалары, 1990 тарафындан тасвирленгени киби, ички транскрипциялангъан аралыкъ (ИТС) сыралавы эсасында даа да тасдыкъланды; Baturo-Ciesniewska ве башкъ., 2017. Къыскъадан айткъанда, изолятлар къартоп декстроза бульонында (КДБ) осьтюрильди ве 25 ± 2 °С температурада 5–7 кунь девамында инкубация этильди. Сонъра мантар мицелийини топлап, пенир махсулатындан сюздилер, стериль сувнен эки кере ювдылар ве стериль сюзгюч кягъытнен къуруттылар. Геномлы ДНК Quick-DNATM мантар/бактерия минипреп комплекти (Курамаэ-Изиока, 1997; Аталла ве башкъ., 2022, 2024) ярдымынен айырылды. Сонъра ИТС рДНК регионы ИТС1/ИТС4 специфик праймер чифтининъ (ТЦКГТАГГТГААККТГКГГ ТККТККГКТТАТТГАТАТГК; бекленильген колем: 540 н.п.) ярдымынен амплификация этильди ( Baturo-Ciesniewska et al., 2017 ). Темизленген ПЦР махсулатлары секвенслемек ичюн берильди (Пекин Аоке Диншенг Биотехнология Ко., Лтд.). ИТС рДНК сыралар Сангернинъ сыраламакъ усулы ярдымынен эки тарафлама сыраладылар. Сонъра топлангъан соргъу сырасы BLASTn программасы ярдымынен GenBank ве Биотехнологиялар акъкъында малюмат миллий меркезинде (NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/) энъ сонъки малюматларнен тенъештирильди. Соргъу сырасы NCBI GenBank-теки сонъки малюматлардан (Къошма S1 джедвели) ClustalW къулланып, Молекуляр эволюцион генетика талиль пакетинде (MEGA-11; 11-нджи версия) алынгъан S. sclerotiorum дигер 20 штаммы/изолятынен тенъештирильди (Kumar ве башкъ., 20). Эвлиявий талиль максималь ихтималлыкъ усулы ве умумий вакъыткъа коре кери къайтарыла бильген нуклеотид ерине къоюлув модели ярдымынен япылды (Ней ве Кумар, 2000). Энъ юксек лог-ихтималлыгъы олгъан терек косьтериле. Эвристик къыдырув ичюн башлангъыч терек къомшу-къошув (НЖ) тереги (Кумар ве башкъ., 2024) ве максималь парсимония (МП) тереги арасында лог-ихтималлыгъы зияде олгъан терекни сечип алмакъ ёлунен сечиле. Н. Дж. тереги умумий вакъыткъа къайтарыла бильген моделни къулланып эсаплангъан чифт месафе матрицасы ярдымынен къурулды (Ней ве Кумар, 2000).
L-орнитиннинъ ве «Ризолекс-Т» бактерицидининъ антибактериаль фаалиети агар диффузия усулы иле in vitro шекильде бельгиленди. Усул: L-орнитиннинъ уйгъун микъдарда запас иляджыны (500 мг/л) алып, оны 10 мл КПК гъыдалы муитнен яхшы этип къарыштырынъыз, сонъки концентрациялары сырасынен 12,5, 25, 50, 75, 100 ве 125 мг/л олгъан иляджларны азырламакъ керек. Контроль оларакъ «Ризолекс-Т» фунгицидининъ беш концентрациясы (2, 4, 6, 8 ве 10 мг/л) ве стериль дистиллят сув къулланылды. Орталыкъ къаттылашкъан сонъ, диаметри 4 мм олгъан Sclerotinia sclerotiorum культурасынынъ тазе азырлангъан мицелий тыкъынтысыны Петри савутынынъ ортасына кечирдилер ве 25±2°С температурада мицелий бутюн контроль Петри савутыны къаплагъандже осьтюрдилер, сонъра мантарларнынъ осьмеси къайд этильди. 1-нджи мусавийликни къулланып, S. sclerotiorum радиаль осьмесининъ фаиз ингибиторлыгъыны эсапла: 1 .
Денъев эки кере текрарланды, эр бир идаре/денъев группасы ичюн алты биологик репликация ве эр бир биологик репликация ичюн беш чанакъ (бир чанакъта эки осюмлик) япылды. Эксперимент нетиджелерининъ догърулыгъыны, ишанчлылыгъыны ве текрарланувыны темин этмек ичюн эр бир биологик репликация эки кере (эки техникий репликация) талиль этильди. Бундан гъайры, ярым максималь ингибитор концентрациясы (ИС50) ве ИС99 эсапламакъ ичюн пробит регрессия талили къулланылды (Прентис, 1976).
Парлица шараитлеринде L-орнитиннинъ потенциалыны къыймет кесмек ичюн, арды-сыра эки къазан теджрибеси кечирильди. Къыскъадан айткъанда, чанакълар стерилизация этильген чамур-къум топрагъынен (3:1) толдурылды ве тазе азырлангъан S. sclerotiorum культурасынен емленди. Биринджиден, S. sclerotiorum энъ инвазив изоляты (3-юнджи изолят) бир склеротийни экиге болип, бетини ашагъы эгип, КПК устюне къойып, 25°С температурада даима къаранлыкъта (24 саат) 4 кунь девамында инкубация этип, мицелийнинъ осьмесини тешвикъат этмек ёлунен осьтюрильди. Сонъра ог четиндеки диаметри 5 мм олгъан дёрт агар тыкъынтысы алынып, 100 г богъдай ве пирнич кепеги стериль къарышмасынен (1:1, об/об) емленди ве бутюн колбалар 25 ± 2 °С температурада 12 с ярыкъ/12 с къаранлыкъ девирде scotitia 5 . Топракъ къошмаздан эвель, бир чешитликни темин этмек ичюн, бутюн колбаларнынъ ичиндекилерни яхшы этип къарыштырдылар. Сонъра, хасталыкъ кетирген махлюкъларнынъ даима концентрациясы олсун деп, эр бир къазангъа 100 г колонизатор кефир къарышмасыны къоштылар. Эмленген савутларгъа мантарларнынъ осювини фаальлештирмек ичюн сув берильди ве 7 кунь девамында теплица шараитинде къоюлды.
Сонъра эр бир чанакъкъа Гиза 3 чешитининъ бешер урлугъы сачылды. L-орнитин ве фунгицид Rizolex-T иле ишленген савутлар ичюн стерилизация этильген урлукълар башта эки саат девамында эки бирикменинъ сувлу иляджында, сонъки IC99 концентрациясы сырасынен 250 мг/л ве 50 мг/л якъын олгъанда, сонъра бир саат девамында авада къурутылгъандан эвель, батырылды. Дигер тарафтан, урлукъларны менфий контроль оларакъ стериль дистиллят сувгъа батырдылар. куньден сонъ, биринджи суварувдан эвель, фиданларны инджелеп, эр бир чанакъта тек эки темиз фидан къалды. Бундан гъайры, S. sclerotiorum иле зарарланувны темин этмек ичюн, стерилизациялангъан скальпель ярдымынен эки чешит ерде айны инкишаф этюв дереджесинде (10 кунь) бакъла осюмлигининъ саплары кесильди ве эр бир ярагъа тахминен 0,5 г колонизация япкъан кефир къарышмасыны къоюлды, сонъра бутюн хасталыкъны инкишаф эттирмек ичюн юксек дымлыкъны тешвикъат эттилер. Незарет осюмликлери де бойле яраландылар ве ярагъа мусавий микъдарда (0,5 г) стериль, колонизацияланмагъан кефир къарышмасы къоюлды ве хасталыкъларнынъ инкишафы ичюн муитни импульслендирмек ве тедавийлев группалары арасында уйгъунлыкъны темин этмек ичюн юксек дымлыкъта тутулды.
Ишлев усулы: бакъла фиданларыны топракъны суварып, 500 мл L-орнитиннинъ (250 мг/л) я да Ризолекс-Т фунгицидининъ (50 мг/л) сувлу иляджынен сувардылар, сонъра 10 кунь аралыкънен учь кере ишлевни текрарладылар. Плацебонен ишленген контроль 500 мл стериль дистиллят сувнен суварылды. Бутюн ишлевлер теплица шараитлеринде (25 ± 2°С, 75 ± 1% нисбий дымлыкъ, ве 8 с ярыкъ/16 с къаранлыкъ фотопериод) япылды. Бутюн чанакълар эки афталыкъ суварылды ве эр ай мувазенели НПК губресинен (20-20-20, 3,6% кварц ве ТЭ микроэлементлери олгъан; Zain Seeds, Мысыр) 3–4 г/л концентрацияда япракъларгъа ягъ ягъдырув ёлунен истисалджынынъ конкрет сортына коре тевсиелерге коре ишленди'. Башкъа шей косьтерильмеген олса, эр бир биологик репликадан 72 саатте ишленген сонъ (хпт) толусынен кенишлеген пишкин япракълар (тёпеден 2-нджи ве 3-нджи япракълар) топланды, гомогенлештирильди, бирлештирильди ве -80 °С температурада илеридеки анализлер ичюн сакъланды, шу джумледен, амма сынъырланмайып, энситуаль пероксидация, гистохимик гистохимик индикаторлар . ве ферментсиз антиоксидантлар ве ген экспрессиясы.
Беяз куф инфекциясынынъ интенсивлигини емден сонъ 21 куньде эр афта (дпи) 1–9 шкаласы (S2 къошма джедвели) къулланып, Теран ве башкъалары тарафындан денъиштирильген Пецольдт ве Диксон шкаласына (1996) эсасланып къыймет кескенлер. (2006 сенеси). Къыскъадан айткъанда, тююмлерара ве тююмлер боюнджа лезетлернинъ огге кетювини козетмек ичюн, емленген ерден башлап, бакъла осюмликлерининъ саплары ве пытакълары тешкерильди. Сонъра лезиянынъ ем нокътасында сап я да пытакъ боюнджа энъ узакъ нокътагъа къадар олгъан месафеси ольченильди ве лезиянынъ ерлешкен ерине коре 1–9 балл къоюлды, мында (1) ем нокътасы янында корюнген инфекция олмагъаныны косьтере ве (2–9) лезиянынъ noulong size a/S inter2 лезиясынынъ кет-кете арткъаныны косьтере (Таблица S2). Сонъра беяз куф инфекциясынынъ интенсивлигини 2 формула ярдымынен фаизге чевирдилер:
Бундан гъайры, хасталыкънынъ прогрессив эгриси (АУДПК) астындаки мейданлыкъ якъында 3-юнджи мусавийлеме ярдымынен умумий бакъланынъ беяз чюрюклиги ичюн уйгъунлаштырылгъан формула (Шанер ве Финни, 1977) ярдымынен эсапланды (Чаухан ве башкъ., 2020).
Бу ерде Yi = ти вакъытта хасталыкънынъ агъырлыгъы, Yi+1 = невбеттеки вакъытта хасталыкънынъ агъырлыгъы ti+1, ti = биринджи ольчю вакъты (куньлерде), ti+1 = невбеттеки ольчю вакъты (куньлерде), n = вакъыт нокъталары я да козетюв нокъталарынынъ умумий сайысы. Бутюн биологик репликацияларда 21 кунь девамында эр афта бакъла осюмлигининъ осьюв параметрлери, шу джумледен осюмликнинъ юксеклиги (см), бир осюмликтеки пытакъларнынъ сайысы, бир осюмликтеки япракъларнынъ сайысы къайд этильди.
Эр бир биологик репликада япракъ нумюнелери (тёпеден экинджи ве учюнджи толусынен инкишаф эттирильген япракълар) тедавийленген сонъ 45-нджи куню (сонъки тедавийленген сонъ 15 кунь) топланды. Эр бир биологик репликация беш чанакътан ибарет эди (бир чанакъта эки осюмлик). Къаранлыкъта 4 °С температурада 80% ацетон къулланып, фотосинтез пигментлерини (хлорофилл а, хлорофилл б ве каротиноидлерни) чыкъармакъ ичюн эзильген токъумадан 500 мг якъын къулланылды. сааттан сонъ нумюнелер центрифугагъа къоюлды ве хлорофилл а, хлорофилл б ве каротиноидлернинъ микъдарыны колориметрик ёлнен УФ-160А спектрофотометр (Shimadzu Corporation, Япония) ярдымынен (Lichtentharing measure37 at1) усулы боюнджа топлады. далгъа узунлыкълары (А470, А646 ве А663 нм). Ниает, фотосинтез пигментлерининъ микъдары Лихтенталер (1987) тарафындан тасвирленген ашагъыдаки 4–6 формулалар ярдымынен эсапланды.
Ишленген сонъ 72 саатте (hpt) эр бир биологик репликаттан япракълар (тёпеден экинджи ве учюнджи толусынен инкишаф этти япракълар) гидроген пероксидининъ (H2O2) ве супероксид анионынынъ (O2•−) in situ гистохимик локализациясы ичюн топланды. Эр бир биологик репликация беш чанакътан ибарет эди (бир чанакъта эки осюмлик). Усулнынъ догърулыгъыны, ишанчлылыгъыны ве текрарланувыны темин этмек ичюн эр бир биологик репликация дубликатта (эки техникий репликация) талиль этильди. H2O2 ве O2•− 0,1% 3,3′-диаминобензидин (DAB; Sigma-Aldrich, Дармштадт, Германия) я да нитромавы тетразолий (NBT; Sigma-Aldrich, Дармштадт, Германия) къулланып, Ромеро-П ве аль-П тарафындан тасвирленген усулларгъа коре бельгиленди. (2004) ве Адам ве башкъ. (1989) кичик денъишмелернен чыкъарылгъан. H2O2 нинъ in situ гистохимиявий локализациясы ичюн листоклар 10 мМ Трис буферинде (рН 7,8) 0,1% ДАБ иле вакуум инфильтрациясы япылды ве сонъра ода араретинде ярыкъта 60 дакъкъа девамында инкубация этильди. Япракъчыкълар 0,15% (об/об) ТСА иле 4:1 (об/об) этанол:хлороформда (Аль-Гомхория фармацевтика ве тиббий махсулатлар, Къаир, Мысыр) агъартылды ве сонъра къараргъандже ярыкъкъа чыкъарылды. Айны шекильде, клапанларгъа O2•− нинъ in situ гистохимик локализациясы ичюн 0,1 мас./об.% ГБТ олгъан 10 мМ калий фосфат буфери (рН 7,8) иле вакуум инфильтрациясы япылды. Япракъчыкъларны ода араретинде ярыкъта 20 дакъкъа инкубация этелер, сонъра юкъарыдаки киби агъарталар, сонъра къою кок/мор лекелер пейда олгъандже ярыкълаталар. Алынгъан къою (H2O2 косьтергичи оларакъ) я да кок-мор (O2•− косьтергичи оларакъ) тюснинъ интенсивлиги ImageJ тасвир ишлев пакетининъ Фиджи версиясы ярдымынен къыймет кесильди (http://fiji.sc; 2024 сенеси март 7 куню чыкъарылды).
Малондиальдегид (МДА; липидлернинъ пероксидациясынынъ маркери оларакъ) Ду ве Брамлагенинъ (1992) усулы боюнджа бираз денъиштирювлернен бельгиленди. Эр бир биологик репликаттан япракълар (тёпеден экинджи ве учюнджи толу инкишафлы япракълар) ишленген сонъ 72 саат (хпт) топланды. Эр бир биологик репликацияда беш чанакъ (бир чанакъта эки осюмлик) бар эди. Усулнынъ догърулыгъыны, ишанчлылыгъыны ве текрарланувыны темин этмек ичюн эр бир биологик репликация дубликатта (эки техникий репликация) талиль этильди. Къыскъадан айткъанда, 0,01% бутилленген гидрокситолуол (БГТ; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) олгъан 20% трихлорсирке экшилиги (ТХА; MilliporeSigma, Burlington, MA, USA) иле МДА экстракциясы ичюн 0,5 г ер япракъ токъумасы къулланылды. Сонъра супернатанттаки МДА микъдарыны УФ-160А спектрофотометри (Shimadzu Corporation, Япония) ярдымынен 532 ве 600 нм-де абсорбцияны ольчемек ёлунен колориметрик ёлнен бельгиледилер ве сонъра нмоль g−1 FW оларакъ ифаде эттилер.
Ферментсиз ве ферментли антиоксидантларны къыймет кесмек ичюн эр бир биологик репликаттан япракълар (тёпеден экинджи ве учюнджи толусынен инкишаф эттирильген япракълар) ишлевден сонъ 72 саатте (хпт) топланды. Эр бир биологик репликация беш чанакътан ибарет эди (бир чанакъта эки осюмлик). Эр бир биологик нумюне дубликатта (эки техникий нумюне) талиль этильди. Эки япракъны сувлу азотнен уваладылар ве догърудан-догъру ферментли ве ферментсиз антиоксидантларны, умумий аминокислоталарны, пролиннинъ микъдарыны, генлернинъ экспрессиясыны ве оксалатларнынъ микъдарыны бельгилемек ичюн къулландылар.
Умумий ириген феноликлер Фолин-Чиокальтеу реактиви (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) ярдымынен Кахконен ве башкъалары тарафындан тасвирленген усулны бираз денъиштирмекнен бельгиленди. (1999 сенеси). Къыскъадан айткъанда, тахминен 0,1 г гомогенлештирильген япракъ токъумасы 20 мл 80%-ли метанолнен къаранлыкъта 24 саат девамында экстракцияланды ве супернатантны центрифугадан сонъ топладылар. 0,1 мл нумюне экстрактыны 0,5 мл Фолин-Чиокальтеу реактиви (10%) иле къарыштырдылар, 30 с чайкъадылар ве 5 дакъкъа къаранлыкъта къалдырдылар. Сонъра эр бир пробиркагъа 0,5 мл 20%-ли натрий карбонат иляджы (Na2CO3; «Аль-Гомхория» фармацевтика ве тиббий махсулатлар ширкети, Къаир, Мысыр) къошып, яхшы этип къарыштыралар ве ода араретинде къаранлыкъта 1 с инкубация этелер. Инкубациядан сонъ реакция къарышмасынынъ 765 нм-де абсорбциясыны УФ-160А спектрофотометри (Shimadzu Corporation, Япония) ярдымынен ольчедилер. Орнек экстрактларында умумий ириген фенолларнынъ концентрациясы галлик кислотасы калибровка эгриси (Fisher Scientific, Hampton, NH, USA) ярдымынен бельгиленди ве бир грамм тазе агъырлыкъкъа миллиграмм галлик эквиваленти оларакъ ифаделенди (мг ГАЭ g-1 тазе агъырлыкъ).
Джеридан ве башкъаларнынъ усулы боюнджа умумий ириген флавоноидлернинъ микъдары бельгиленди. (2006) китабында бираз денъишмелер кирсетильген. Къыскъадан айткъанда, юкъарыдаки метанол экстрактындан 0,3 мл 0,3 мл 5%-ли алюминий хлорид иляджынен (AlCl3; Fisher Scientific, Hampton, NH, USA) къарыштырылып, кучьлю къарыштырылды ве сонъра ода араретинде 5 дакъкъа девамында инкубация этильди, сонъра a% mssium3teta10 эритмеси къошулды. («Аль-Гомхория» фармацевтика ве тиббий махсулатлар, Къаир, Мысыр), яхшы этип къарыштырылгъан ве ода араретинде къаранлыкъта 30 дакъкъа девамында инкубация этильген. Инкубациядан сонъ реакция къарышмасынынъ 430 нм-де абсорбциясыны УФ-160А спектрофотометри (Shimadzu Corporation, Япония) ярдымынен ольчедилер. Орнек экстрактларында умумий ириген флавоноидлернинъ концентрациясы рутиннинъ калибровка эгриси (TCI America, Portland, OR, USA) ярдымынен бельгиленди ве сонъра бир грамм тазе агъырлыкъкъа миллиграмм рутин эквиваленти оларакъ ифаделенди (мг RE g-1 тазе агъырлыкъ).
Бакъла япракъларындаки умумий сербест аминокислота микъдары Ёкояма ве Хирамацу (2003) тарафындан теклиф этильген ве Sun ве башкъалары тарафындан денъиштирильген усулгъа эсасланып, модификациялангъан нингидрин реактиви (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, USA) ярдымынен бельгиленди. (2006 сенеси). Къыскъадан айткъанда, 0,1 г ер токъумасы рН 5,4 буфернен экстракцияланды, 200 мкл супернатанты исе 200 мкл нингидрин (2%) ве 200 мкл копиридин (10%; Spectrum Chemical, New Brunswick, NJ, USA) иле реакциягъа кирсетильди, къайнатылгъан сувда мин3 000 температурада инкубация этильди. 580 нм-де УФ-160А спектрофотометри («Симадзу» корпорациясы, Япония) ярдымынен ольчедилер. Дигер тарафтан, пролин Бейтс усулы иле бельгиленди (Бейтс ве башкъ., 1973). Пролин 3% сульфосалицил кислотасынен (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, USA) экстракция этильди ве центрифугадан сонъ 0,5 мл супернатанты 1 мл бузлу сирке кислотасынен (Fisher Scientific, Hampton, NH, USA) ве нингидрин реактивинен къарыштырылды, meas000000000000 температурада incu50000 ве000 температурада incu. 520 нм-де юкъарыдаки киби спектрофотометрни къулланып тапынъыз. Япракъ экстрактларындаки умумий сербест аминокислота ве пролин сырасынен глицин ве пролин калибровка эгрилери (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA) ярдымынен бельгиленди ве мг/г тазе агъырлыкъ оларакъ ифаделенди.
Антиоксидант ферментлернинъ фермент фаалиетини бельгилемек ичюн тахминен 500 мг гомогенлештирильген токъума 3 мл 50 мМ Трис буфери (рН 7,8) иле экстракция этильди, онынъ теркибинде 1 мМ ЭДТА-Na2 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) ве 7,5% Sigma-Aldrich, St. Сент-Луис, штат Моссачусетс, АКъШ), 10 000 × г температурада 20 дакъкъа девамында сувутувда (4 °С) центрифугагъа къоюлды ве супернатанты (хам фермент экстракты) топланды (Эль-Нагар ве башкъ., 2023; Осман ве башкъ., 2023). Сонъра каталаза (КАТ) 2 мл 0,1 М натрий фосфат буфери (рН 6,5; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) ве 100 мкл 269 мМ H2O2 иляджынен реакциягъа кирсетильди ве онынъ фермент фаалиетини Aebi sNagar,E4light with1) усулы боюнджа бельгиледилер. 2023 сенеси; Гуаяколгъа багълы пероксидаза (ПОХ) фермент фаалиети Харрах ве башкъаларнынъ усулынен бельгиленди. (2009 сенеси). (2008) кичик модификацияларнен (Эль-Нагар ве башкъ., 2023; Осман ве башкъ., 2023) ве полифенол оксидазанынъ (ППО) фермент фаалиети 2,2 мл 100 мМ натрий фосфат буфери (рН гуакол 6,0 л), 2,2 мл натрий фосфат буфери (рН 6,0 мкИ хемики) иле реакциядан сонъ бельгиленди. Портленд, ОР, АКъШ) ве 100 мкл 12 мМ Н2О2. Усул (Эль-Нагар ве башкъ., 2023; Осман ве башкъ., 2023) ден бираз денъиштирильди. Анализ 0,1 М фосфат буферинде (рН 6,0) тазе азырлангъан 3 мл катехол иляджынен (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, USA) (0,01 М) реакциядан сонъ япылды. КАТ фаалиети 240 нм-де Н2О2 парчаланувыны козетюв ёлунен ольченильди (А240), ПОХ фаалиети 436 нм-де абсорбциянынъ артувыны козетюв ёлунен ольченильди (А436), ППО фаалиети исе 495 нм-де абсорбция флуктуацияларыны язып алув ёлунен ольченильди (А4095 U30 с ичюн U30) . спектрофотометр (Симадзу, Япония) иле къулланылгъан.
Реаль вакъытта РТ-ПЦР антиоксидантларнен багълы учь геннинъ транскрипт севиелерини тапмакъ ичюн къулланылды, оларнынъ арасында пероксисомалы каталаза (PvCAT1; GenBank иле чыкъыш No KF033307.1), супероксиддисмутаза (PvSOD; GenBank иле чыкъыш No XM_06863955 ве РедуктвБанк. Акцессия No KY195009.1), бакъла япракъларында (тёпеден экинджи ве учюнджи толусынен инкишаф этти япракълар) сонъки ишлевден сонъ 72 с. Къыскъадан айткъанда, РНК истисалджынынъ протоколына коре Simply P Total RNA Extraction Kit (Кат. No BSC52S1; BioFlux, Biori Technology, Къытай) ярдымынен айырылды. Сонъра, истисалджынынъ косьтергичи боюнджа TOP scriptTM cDNA Synthesis Kit ярдымынен кДНК синтез этильди. Юкъарыдаки учь геннинъ праймер сырасы S3 къошма джедвельде берильген. Эв хызметчиси гени оларакъ PvActin-3 (GenBank къошулув номерасы: XM_068616709.1) къулланылды ве нисбий ген экспрессиясы 2-ΔΔCT усулы ярдымынен эсапланды (Livak and Schmittgen, 2001). Биотик стресс (умумий богъдай урлукълары ве антракноз мантары Colletotrichum lindemuthianum арасында келишмеген тесирлешюв) ве абиотик стресс (къургъакълыкъ, тузлулыкъ, алчакъ арарет) алтында актиннинъ тургъунлыгъы косьтерильди (Borges ве башкъ., 2012).
Биз ильк оларакъ S. sclerotiorum махлюкъында оксалоацетат атсетилгидролаза (ОАХ) акъикъатларынынъ геном кенишлигинде ин силико анализини акъикъат-акъсил BLAST алетини (BLASTp 2.15.0+) къулланып яптыкъ (Altschul ве башкъ., 1997, 2005). Къыскъадан айткъанда, биз Aspergillus fijiensis CBS 313.89 (AfOAH; таксид: 1191702; GenBank-ке къошулув ракъамы XP_040799428.1; 342 аминокислота) ве Penicillium lagena (PlOAH2; таксид1банкнынъ къошулув номерасы:9) осюмликлеринден ОАХ къулландыкъ. XP_056833920.1; 316 аминокислота) S. sclerotiorum (таксид: 5180) махлюкъындаки гомолог акъны харитагъа чыкъармакъ ичюн соргъу сырасы оларакъ. BLASTp энъ сонъки эльде этильген S. sclerotiorum геном малюматларына къаршы GenBank миллий биотехнология малюмат меркезининъ (NCBI) сайтында, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/ япылды.
Бундан гъайры, S. sclerotiorum (SsOAH) дан тахмин этильген OAH гени ве A. fijiensis CBS 313.89 дан AfOAH ве P. lagena дан PlOAH эволюцион талили ве филогенетик тереги JTamura1, ве2) матрицаларында максималь ихтималлыкъ усулы ярдымынен чыкъарылды. модели (Джонс ве башкъ., 1992). Филогенетик терек S. sclerotiorum дан бутюн тахмин этильген ОАХ генлерининъ (SsOAH) акъсиллернинъ сыраларнынъ чокъ догърултув талили ве сынъырлавлар эсасында догърултув алети (COBALT; https://www.ncbi.nlm.nih.cobalt/tools/ ве Агарвала, 2007 с.). Бундан гъайры, S. sclerotiorum махсулатындан SsOAH энъ яхшы келишкен аминокислота сыралар ClustalW къулланып (http://www.genome.jp/tools-bin ве the conservalw регионыны корьгезмек) къулланып, соргъу сыраларнен (AfOAH ве PlOAH) тегизленди (Ларкин ве башкъ., 2007). ЭСПрипт алети (3.0 версиясы; https://эсприпт.ибцп.фр/ЭСПрипт/ЭСПрипт/индекс.фп).
Бундан гъайры, S. sclerotiorum SsOAH тахмин этильген функциональ темсилий доменлери ве консерватив ерлери InterPro алетини (https://www.ebi.ac.uk/interpro/) къулланып, чешит къоранталаргъа интерактив шекильде тасниф этильди (Blum ве башкъ., 2021). Ниает, тахмин этильген S. sclerotiorum SsOAH учь ольчюли (3D) къурулыш моделлемеси «Беллернинъ гомологиясы/аналогиясыны танымакъ» двигатели (Phyre2 серверининъ 2.0 версиясы; http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/~phyre2/html?gid=page) (Kelleyx/page.) ярдымынен япылды. 2015) ве SWISS-MODEL сервери (https://swissmodel.expasy.org/) ярдымынен тасдыкъланды (Биасини ве башкъ., 2014). Прогноз этильген учь ольчюли къурулышлар (PDB форматында) UCSF-Chimera пакетининъ (версия 1.15; https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/ ) ярдымынен интерактив шекильде корюнтиленди (Pettersen ве башкъ., 2004).
Sclerotinia sclerotiorum мицелийлеринде оксалоацетат атсетилгидролазанынъ (SsOAH; GenBank къошулув номерасы: XM_001590428.1) транскрипция севиесини бельгилемек ичюн микъдарий акъикъий вакъыттаки флюоресцент ПЦР къулланылды. Къыскъадан айткъанда, S. sclerotiorum ичине ПДБ олгъан колбагъа емленди ве 25 ± 2 °С температурада 24 саат девамында 150 айланув/дакъкъада ве даима къаранлыкъта) чайкъалгъан инкубаторгъа (модель: I2400, New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ, USA) къоюлды, бойлеликнен, myceal осьювини (24 h) тешвикъат эттилер. Бундан сонъ улькелерни L-орнитин ве Rizolex-T фунгицидинен сонъки IC50 концентрацияларында (тахминен 40 ве 3,2 мг/л) ишледилер ве сонъра айны шараитлерде даа 24 саат девамында осьтюрдилер. Инкубациядан сонъ культуралар 5 дакъкъа девамында 2500 айланув/дакъкъада центрифугагъа къоюлды ве ген экспрессиясы анализи ичюн супернатанты (мантар мицелий) топланды. Айны шекильде, мантар мицелийлери инфекциядан сонъ 0, 24, 48, 72, 96 ве 120 саатте зарарлангъан токъумаларнынъ устюнде беяз куф ве памукълы мицелий пейда олгъан зарарлангъан осюмликлерден топланды. Мантар мицелийинден РНК чыкъарылды ве сонъра, юкъарыда тасвирленгени киби, кДНК синтез этильди. SsOAH ичюн праймерлернинъ сырасы S3 къошма джедвельде берильген. Эв хызметчиси гени оларакъ SsActin (GenBank къошулув ракъамы: XM_001589919.1) къулланылды, нисбий ген экспрессиясы исе 2-ΔΔCT усулы ярдымынен эсапланды (Livak and Schmittgen, 2001).
Къартоп декстроза бульонында (КДБ) ве теркибинде Sclerotinia sclerotiorum мантар патогени олгъан осюмлик нумюнелеринде оксал кислотасы Сю ве Чжаннынъ (2000) усулы боюнджа бираз денъиштирювлернен бельгиленди. Къыскъадан айткъанда, S. sclerotiorum изолятлары ичинде ПДБ олгъан колбаларгъа емленди ве сонъра чайкъалув инкубаторында (модель I2400, New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ, USA) 150 айланув/дакъкъада 25 ± 2 °C температурада 3–5 кунь девамында дам. Инкубациядан сонъ мантар культурасы башта Whatman #1 фильтр кягъытындан сюзюльди, сонъра къалгъан мицелийни чыкъармакъ ичюн 5 дакъкъа девамында 2500 айланув/дакъкъада центрифугагъа къоюлды. Супернатантны топлап, 4°С температурада сакълап, оксалатнынъ микъдарыны илериде бельгиледилер. Осюмлик нумюнелерини азырламакъ ичюн дистиллят сувнен учь кере (эр сефер 2 мл) тахминен 0,1 г осюмлик токъума парчачыкълары чыкъарылды. Сонъра нумюнелер 2500 айланув/дакъкъада 5 дакъкъа девамында центрифугагъа къоюлды, супернатанты Whatman No 1 фильтр кягъытындан къуру сюзюльди ве илеридеки талиль ичюн топланды.
Оксаль экшилигининъ микъдарий талили ичюн реакция къарышмасыны джамлы тыкъынтылы пробиркада бойле тертипте азырладылар: 0,2 мл нумюне (я да ПДБ культурасы фильтраты я да оксаль экшилигининъ стандарт иляджы), 0,11 мл бромфенол мавысы (БПБ, 1 мМ; Fisher Chemical, PA8fu, USA9h m0l. кислота (H2SO4; Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Къаир, Мысыр) ве 0,176 мл 100 мМ калий дихромат (K2Cr2O7; TCI chemicals, Portland, OR, USA) иле ерлештирильди, сонъра исе эритмени 4,8 мл вакселлемедитернен дивигородлы ве 4,8 мл ваксемедит иле иритильди. °С сув ваннасында ерлештириле. дакъкъадан сонъ 0,5 мл натрий гидроксидининъ иляджыны (NaOH; 0,75 М) къошып, реакцияны токътаттылар. Реакция къарышмасынынъ абсорбциясы (А600) 600 нм-де УФ-160 спектрофотометр (Shimadzu Corporation, Япония) ярдымынен ольченильди. Культура фильтратлары ве осюмлик нумюнелерининъ микъдарыны эсапламакъ ичюн сырасынен ПДБ ве дистиллят сув къулланылды. Культура фильтратларында, ПДБ муитининъ бир миллилитрине микрограмм оксалик экшилиги (мкг.мл−1) ве япракъ экстрактларында, бир грамм тазе агъырлыкъта микрограмм оксалик экшилиги оларакъ ифаделенген (мкг.г−1 ФВ) оксалик экшиликнинъ концентрациясы курветамThe calirmosher Calibration (Walmical acid calibration) ярдымынен бельгиленди. М.А., АКъШ).
Бутюн огренюв девамында бутюн теджрибелер бутюнлей рандомизациялангъан дизайнда (БРД) уйдурылды, эр бир тедавийлевде алты биологик репликация ве эр бир биологик репликацияда беш чанакъ (бир чанакъта эки осюмлик) бар эди, эгер башкъа шей косьтерильмеген олса. Биологик репликалар дубликатта (эки техникий репликалар) талиль этильди. Айны экспериментнинъ текрарланувыны тешкермек ичюн техникий текрарлавлар къулланылды, амма яланджы текрарлавлардан къачынмакъ ичюн статистик талильде къулланылмады. Малюматлар дисперсия талили (АНОВА) ярдымынен статистик талиль этильди, сонъра Тукей-Крамернинъ намуслы эмиетли фаркъ (НЭФ) тести (р ≤ 0,05) япылды. In vitro теджрибелери ичюн пробит модели ярдымынен IC50 ве IC99 къыйметлери эсапланды ве 95% ишанч аралыкълары эсапланды.
Мысырнынъ Эль-Габия виляетиндеки чешит соя тарлаларындан эписи олып дёрт изолят топланды. КПК муитинде бутюн изолятлар къаймакълы беяз мицелий чыкъардылар, олар тез памукъ киби беязгъа чевирильдилер (1А рес.), сонъра исе склероз басамакъта беж я да къою тюске чевирильдилер. Склеротиялар, адет узьре, сыкъ, къара, сферик я да тертипсиз шекильде, узунлыгъы 5,2 — 7,7 мм, диаметри 3,4 — 5,3 мм ола (1, В рес.). Дёрт изолят 25 ± 2 °С температурада 10–12 кунь инкубациядан сонъ культура муитининъ четинде склеротиянынъ маргинал шекилини инкишаф эттирсе де (1А рес.), оларнынъ арасында бир пластинкада склеротияларнынъ сайысы эмиетли дереджеде фаркълы эди (Р < 0,001), изолятнынъ энъ юксек га2а (10,001 га3а). Бир левхада 1,53 склеротия; Айны шекильде, #3 изолятында ПДБ-де башкъа изолятларгъа коре зияде оксалат кислота чыкъарылды (3,33 ± 0,49 мкг.мл−1; 1Д рес.). No3 изолятында фитопатоген мантар Sclerotinia sclerotiorum типик морфологик ве микроскопик хусусиетлери косьтерильди. Меселя, КПК-де No3 изолятнынъ колониялары тез осьти, къаймакълы беяз (1А рес.), терс беж я да ачыкъ лосось сары-къызыл тюсте олды ве 9 см диаметрли левханынъ юзюни толусынен къапламакъ ичюн 25 ± 2°С температурада 6-7 кунь керек олды. Юкъарыдаки морфологик ве микроскопик хусусиетлерге эсасланып, #3 изолят Sclerotinia sclerotiorum оларакъ белли этильди.
рес-де умумий богъдай осюмликлеринден S. sclerotiorum изолятларынынъ хусусиетлери ве патогенлиги. (А) ПДА муитинде дёрт S. sclerotiorum изолятынынъ мицелий осьмеси, (Б) дёрт S. sclerotiorum изолятынынъ склерозиясы, (В) склерозияларнынъ сайысы (бир пластинкада), (Г) ПДБ муитинде оксалат кислота секрециясы (мкг.мл−1), ве (Д) хасталыкънынъ S. теплица шараитлеринде тиджарет богъдай урлугъынынъ сезимли Гиза 3 сою. Къыйметлер беш биологик текрарлавнынъ орта ± СД-сини косьтере (n = 5). Чешит арифлер тедавийлер арасында статистик джеэттен эмиетли фаркъларны косьтере (р < 0,05). (Ф–Н) Ер устюндеки сапларда ве кремнийлерде типик беяз куф аляметлери #3 изолят (дпи) иле емленген сонъ 10 кунь кечкен сонъ пейда олды. (I) S. sclerotiorum #3 изолятынынъ ички транскрипциялангъан аралыкъ (ИТС) регионынынъ эволюцион талили максималь ихтималлыкъ усулы ярдымынен япылды ве Биотехнология малюматлары миллий меркезининъ (NCBI) малюмат базасындан (httbihps://vwwwm.) эльде этильген 20 истинадий изолят/штаммнен тенъештирильди. Кластерлештирюв сызыкълары устюндеки ракъамлар регионнынъ къапламасыны (%), кластерлештирюв сызыкълары тюбюндеки ракъамлар исе пытакъ узунлыгъыны косьтере.
Бундан гъайры, патогенлигини тасдыкъламакъ ичюн, эльде этильген S. sclerotiorum дёрт изоляты теплица шараитлеринде сезимли тиджарет бакъла союны Giza 3 емлемек ичюн къулланылды, бу исе Кохнынъ постулатларына келише (1Е рес.). Алынгъан бутюн мантар изолятлары патоген олып, ешиль бакъланы зарарлай бильселер де (с. Гиза 3), ер устюндеки бутюн къысымларда (1Ф рес.), хусусан сапларда (1Г рес.) ве пытакъларда (1Н рес.) типик беяз куф аляметлерини догъурсалар да, инокуляциядан сонъ (1Н рес. эки мустакъиль теджрибеде агрессив изолят тапты. изолят бакъла осюмликлеринде хасталыкънынъ энъ юксек агъырлыгъына (%) (24,0 ± 4,0, 58,0 ± 2,0, ве 76,7 ± 3,1 инфекциядан сонъ 7, 14 ве 21 куньде; 1Ф рес.).
Энъ инвазив S. sclerotiorum изолятынынъ #3 айдынлатмасы ички транскрипциялангъан аралыкъ (ИТС) сыралавы эсасында даа да тасдыкъланды (1I рес.). #3 изолят ве 20 истинадий изолят/штамм арасындаки филогенетик талиль оларнынъ арасында юксек бенъзешювни (>99%) косьтере. Шуны къайд этмек керек ки, S. sclerotiorum изоляты #3 (533 н.п.) къуру нохут урлукъларындан айырылгъан американ S. sclerotiorum изоляты LPM36 (GenBank къошулув номерасы MK896659.1; 540 н.п.) ве къытай S.sclerotio1K number Y2B иле юксек бенъзешювге маликтир. OR206374.1; 548 н.п.), бу исе менълибай (Matthiola incana) сап чюрюклигине себеп ола, оларнынъ эписи дендрографиянынъ устюнде айрыджа группалангъан (1I рес.). Янъы сырасы NCBI малюмат базасына къоюлды ве «Sclerotinia sclerotiorum – изолят YN-25» (GenBank PV202792 къошулув номерасы) адыны алды. 3-юнджи изолят энъ инвазив изолят олгъаныны корьмек мумкюн; шунынъ ичюн бу изолят бутюн сонъки теджрибелерде огренильмек ичюн сечильди.
Диамин L-орнитиннинъ (Sigma-Aldrich, Дармштадт, Алмания) чешит концентрацияларда (12,5, 25, 50, 75, 100 ве 125 мг/л) S. sclerotiorum изолят 3 къаршысында антибактериаль фаалиети in vitro шекильде огренильди. L-орнитиннинъ антибактериаль тесири косьтергени ве дозагъа коре S. sclerotiorum гифаларынынъ радиаль осьмесини яваш-яваш ингибирлегени дикъкъаткъа ляйыкътыр (2А, В рес.). Текширильген энъ юксек концентрацияда (125 мг/л) L-орнитин мицелийнинъ осьмесининъ энъ юксек ингибиторлыгъыны косьтере (99,62 ± 0,27%; 2В рес.), бу тиджарет фунгициди Rizolex-T тестине эквивалент эди) (ингибиторлыкъ тезлиги энъ юксек 99,С рес.3% the 99,45 рес. (10 мг/л), бу да бойле эффективликни косьтере.
рес-де L-орнитиннинъ Sclerotinia sclerotiorum къаршысында in vitro антибактериаль фаалиети. А) S. sclerotiorum къаршы чешит концентрациялы L-орнитиннинъ антибактериаль фаалиетини тиджарет фунгициди Rizolex-T (10 мг/л) иле тенъештирюв. (В, С) L-орнитиннинъ чешит концентрацияларынен (12,5, 25, 50, 75, 100 ве 125 мг/л) я да Ризолекс-Т (2, 4, 6, 8 ве мг/л), 10 мг/л) чешит концентрацияларнен тедавийленген сонъ S. sclerotiorum мицелийнинъ осьмесининъ ингибиторлыгъынынъ тезлиги (%). Къыйметлер беш биологик текрарлавнынъ орта ± СД-сини косьтере (n = 5). Чешит арифлер тедавийлер арасындаки статистик фаркъларны косьтере (р < 0,05). (Д, Е) Пробит моделининъ регрессия талили сырасынен L-орнитин ве тиджарет фунгициди Ризолекс-Т. Пробит моделининъ регрессия сызыгъы къатты кок сызыкъ, ишанч аралыгъы (95%) исе кесикли къырмызы сызыкъ шеклинде косьтериле.
Бундан гъайры, пробит регрессия талили япылды ве уйгъун графиклер 1 джедвельде ве 2Д,Е ресимлерде косьтерильди. Къыскъадан айткъанда, L-орнитиннинъ къабул этильген эниш къыймети (y = 2,92x − 4,67) ве онен багълы эмиетли статистика (Cox & Snell R2 = 0,3709, Nagelkerke R2 = 0,4998 ве p < 0,0001; 2D рес. фунгицид Ризолекс-Т (у = 1,96х − 0,99, Кокс & Снелл Р2 = 0,1242, Нагелькерке Р2 = 0,1708 ве р < 0,0001) (1 табл.).
Таблица 1. S. sclerotiorum къаршысында L-орнитиннинъ ве «Rizolex-T» тиджарет фунгицидининъ ярым максималь ингибитор концентрациясынынъ (IC50) ве IC99 (мг/л) къыйметлери.
Умумен, L-орнитин (250 мг/л) ишленген умумий бакъла осюмликлеринде беяз куфнинъ инкишафыны ве агъырлыгъыны, ишленмеген S. sclerotiorum иле зарарлангъан осюмликлерге коре, сезилерли дереджеде эксильтти (контроль; 3А рес.). Къыскъадан айткъанда, тедавийленмеген зарарлангъан контроль осюмликлернинъ хасталыкъ агъырлыгъы яваш-яваш артса да (52,67 ± 1,53, 83,21 ± 2,61, ве 92,33 ± 3,06%), L-орнитин бутюн эксперимент девамында хасталыкънынъ агъырлыгъыны (%) эмиетли дереджеде эксильтти, ±0,0 (8,0). 1,00, ве 26,36 ± 3,07) тедавийден сонъ 7, 14 ве 21 куньде (дпт) (3А рес.). Айны шекильде, S. sclerotiorum иле зарарлангъан бакъла осюмликлери 250 мг/л L-орнитиннен ишленгенде, хасталыкънынъ прогрессив эгриси (АУДПК) астындаки мейданлыкъ ишленмеген контрольде 1274,33 ± 33,13-тен 281,03 ± 7,95-ке эксильди, бу исе мг/0 мг/0 мусбет ярыкътан ашагъы эди. Ризолекс-Т фунгициди (183,61 ± 7,71; 3В рес.). Экинджи теджрибеде де айны тенденция козьге чарпты.
рес., теплица шараитлеринде Sclerotinia sclerotiorum иле пейда олгъан умумий бакъланынъ беяз чюрюклигининъ инкишафына L-орнитиннинъ экзоген къулланувынынъ тесири. А) 250 мг/л Л-орнитиннен тедавийленген сонъ, умумий бакъланынъ беяз куфининъ хасталыкънынъ огге кетюв эгриси. Б) Л-орнитиннен тедавийленген сонъ, адий бакъланынъ беяз куфининъ хасталыкънынъ огге кетюв эгриси (АУДПК) астындаки мейданлыкъ. Къыйметлер беш биологик текрарлавнынъ орта ± СД-сини косьтере (n = 5). Чешит арифлер тедавийлер арасында статистик джеэттен эмиетли фаркъларны косьтере (р < 0,05).
250 мг/л L-орнитинни экзоген шекильде къулланув 42 куньден сонъ осюмликнинъ юксеклигини (4А рес.), бир осюмликке пытакъларнынъ сайысыны (4В рес.), бир осюмликке япракъларнынъ сайысыны (4С рес.) яваш-яваш арттырды. Тиджарет фунгициди Ризолекс-Т (50 мг/л) огренильген бутюн гъыда параметрлерине энъ буюк тесир этсе, 250 мг/л L-орнитиннинъ экзоген къулланылувы, ишленмеген контрольге коре, экинджи буюк тесирни косьтерди (4А–С рес.). Дигер тарафтан, L-орнитиннен тедавийлев фотосинтез пигментлери f хлорофилл а (4Д рес.) ве хлорофилл б (4Е рес.) микъдарына ич бир тюрлю эмиетли тесир этмеди, амма менфий контрольге коре умумий каротиноидлернинъ микъдарыны бираз арттырды (0,56 ± 0,03 мг/г4 ​​wt2 ±03 мг/г fr wt. мусбет контроль (0,46 ± 0,02 мг/г фр масса; 4Ф рес.). Умумен, бу нетиджелер L-орнитиннинъ ишленген богъдай осюмликлери ичюн фитотоксик олмагъаныны ве атта оларнынъ осьмесини тешвикъат эте биледжегини косьтере.
рес.Экзоген L-орнитин къулланувынынъ теплица шараитлеринде Sclerotinia sclerotiorum иле зарарлангъан бакъла япракъларынынъ осьюв хусусиетлерине ве фотосинтез пигментлерине тесири. А) осюмликнинъ юксеклиги (см), Б) бир осюмликтеки пытакъларнынъ сайысы, В) бир осюмликте япракъларнынъ сайысы, Г) хлорофилл а микъдары (мг г-1 фр вес), Д) хлорофилл б микъдары (мг г-1 фр вес), Е) умумий каротиноидлернинъ микъдары (мг г-1 фр). Къыйметлер беш биологик текрарлавнынъ орталама ± СД (n = 5) ола. Чешит арифлер тедавийлер арасында статистик джеэттен эмиетли фаркъларны косьтере (р < 0,05).
Реактив оксиген тюрлерининъ (РОС; гидроген пероксиди [H2O2] шеклинде ифаделенген) ве сербест радикалларнынъ (супероксид анионлары [O2•−] шеклинде ифаделенген) in situ гистохимиявий локализациясы L-орнитиннинъ (250 мг/л) экзоген къулланылувы H2 ±5.30 топланувыны эмиетли дереджеде эксильткенини косьтере. нмоль.г−1 ФВ; 5А рес.) ве О2•− (32,69 ± 8,56 нмоль.г−1 ФВ; 5В рес.) эм ишленмеген зарарлангъан осюмликлернинъ топланувына коре (173,31 ± 12,06 ве 149,35 ± 7,94 нмоль ре-спективли ФВ,5. мг/л тиджарет фунгициди Ризолекс-Т (170,12 ± 9,50 ве 157,00 ± 7,81 нмоль.г−1 фр масса) 72 с. hpt алтында топлангъан H2O2 ве O2•− юксек севиелери (5А, В рес.). Айны шекильде, ТСА эсасында япылгъан малондиальдегид (МДА) анализи S. sclerotiorum иле зарарлангъан бакъла осюмликлерининъ япракъларында МДА зияде (113,48 ± 10,02 нмоль.г fr wt) топлангъаныны косьтере (5С рес.). Лякин L-орнитиннинъ экзоген къулланылувы липидлернинъ пероксидациясыны эмиетли дереджеде эксильтти, буны ишленген осюмликлерде МДА микъдарынынъ эксильмеси исбатлай (33,08 ± 4,00 нмоль.г фр вес).
рес., теплица шараитлеринде S. sclerotiorum иле зарарлангъан бакъла япракъларында экзоген L-орнитиннинъ оксидатив стресснинъ эсас маркерлерине ве ферментсиз антиоксидант къорчалав механизмлерине тесири. А) 72 л.с.-де водород пероксиди (Н2О2; нмоль г−1 ФВ), Б) 72 л.с.-де супероксид анионы (О2•−; нмоль г−1 ФВ), В) 72 л.с. Д) 72 л.с.-де умумий ириген флавоноидлер (мг РЭ г−1 ФВ), Е) 72 л.с.-де умумий сербест аминокислота (мг г−1 ФВ) ве 72 л.с. Къыйметлер 5 биологик текрарлавнынъ (n = 5) орта ± стандарт сапмасыны (орта ± СС) косьтере. Чешит арифлер тедавийлер арасында статистик джеэттен эмиетли фаркъларны косьтере (р < 0,05).