Шимдики *Шимдики адрес: Кельн 50931, Алмания, Кельн мукеммеллик кластерининъ къартлыкънен багълы хасталыкъларда улькевий стресс джевабы боюнджа араштырмалары (CECAD).
Митохондрия хасталыкъларынынъ нейродегенерациясы къайтарып оламагъан сайыла, чюнки нейронларнынъ метаболизм пластичности сынъырлыдыр, амма митохондрия дисфункциясынынъ организмде нейрон метаболизмининъ ульке мустакъиллигине тесири яхшы анълашылмай. Мында биз митохондрияларнынъ бозулгъан бирлешюв динамикасы себебинден прогрессив ОКСФОС эксиклиги олгъан Пуркинже нейронларынынъ улькеге хас протеомасыны кирсетемиз. Биз митохондрия дисфункциясы протеомика саасында терен денъишювни къозгъагъаныны, сонъунда улькенинъ олюминден эвель догъру метаболизм программаларынынъ сыралы фаальлешмесине кетиргенини таптыкъ. Биз бекленильмеген алда пируват карбоксилаза (ПКх) ве ТСА девирининъ ара мадделерини толдурувнен багълы олгъан дигер пероксидазаларнынъ ачыкъ-айдын индукциясыны бельгиледик. ПКхнинъ ингибиторлыгъы оксидатив стрессни ве нейродегенерацияны кескинлештирди, бу исе атеросклерознынъ ОКСФОС етишмеген нейронларда къорчалав тесири олгъаныны косьтере. Терминаль дегенерациягъа огърагъан нейронларда митохондрияларнынъ бирлешмесининъ тикленюви бу метаболизм хусусиетлерини бутюнлей терсине чевире ве бунынънен улькенинъ олюмининъ огюне кете. Бизим тапмаджаларымыз митохондрия дисфункциясына къаршы турмакъ кучюни берген эвель белли олмагъан ёлларны айырып косьтере ве хасталыкънынъ сонъки девирлеринде биле нейродегенерацияны кери къайтармакъ мумкюн олгъаныны косьтере.
Нейрон энергиясы метаболизмини девам эттирювде митохондрияларнынъ меркезий ролюни инсан митохондрия хасталыкъларынен багълы олгъан кенъ неврологик аляметлер айрыджа къайд этелер. Бу хасталыкъларнынъ чокъусы митохондрия генлерининъ экспрессиясыны низамлагъан ген мутацияларындан (1, 2) я да митохондрия динамикасынен багълы генлернинъ ёкъ этильмесинден пейда ола, олар митохондрия ДНК-сынынъ (мтДНК) тургъунлыгъына вастасыз тесир этелер (3, 4). Айван моделлеринде япылгъан ишлер шуны косьтере ки, этрафтаки токъумаларда митохондрия дисфункциясына джевап оларакъ, консерватив метаболизм ёллары (5-7) фаальлештириле биле, ве бойлеликнен, бу муреккеп хасталыкъларнынъ патогенези акъкъында муим малюматлар бериле. Бунъа къаршылыкъ оларакъ, бизим мий митохондрияларында аденозинтрифосфат (АТФ) мейдангъа кетирювнинъ умумий етишмезлиги себебинден пейда олгъан специфик ульке тюрлерининъ метаболизм денъишмелери акъкъында бизим анълайышымыз темельдир (8), хасталыкъларнынъ огюне кечмек я да оларнынъ огюне кечмек ичюн къулланмакъ мумкюн олгъан терапевтик нишанларны бельгилемек кереклигини къайд эте. Нейродегенерациянынъ огюне кечмек (9). Малюматнынъ эксиклиги шунда ки, нерва укюретлери этрафтаки токъумаларнынъ укюрет чешитлерине коре пек сынъырлы метаболизм эгильмеси олгъаны кениш суретте сайыла (10). Бу улькелернинъ синаптик ёлланувны тешвикъат этмек ве яраланув ве хасталыкъ шараитлерине джевап бермек ичюн нейронларгъа метаболитлернинъ еткизильмесини координация этмекте меркезий роль ойнагъаныны козь огюне алсакъ, ульке метаболизмини мий токъумасынынъ къыйын шараитлерине уйдурмакъ къабилиети деерлик глиаль улькелернен сынъырлана (11-14). Бундан да гъайры, мий токъумасынынъ табиий улькевий гетерогенлиги белли бир нейрон алт группаларында олып кечкен метаболизм денъишмелерини огренмеге чокъ кедер эте. Нетиджеде, нейронларда митохондрия дисфункциясынынъ догъру улькевий ве метаболизм нетиджелери акъкъында пек аз малюмат бар.
Митохондрия дисфункциясынынъ метаболизм нетиджелерини анъламакъ ичюн биз митохондрия тышкъы зар синтезининъ (Mfn2) ёкъ этильмеси себебинден пейда олгъан нейродегенерациянынъ чешит басамакъларындаки Пуркинже нейронларыны (ПН) айырды эттик. Инсанларда Mfn2 мутациялары Шарко-Мари-Тут 2А типи оларакъ белли олгъан ирсий арекет сезиджи нейропатиянынъ бир чешитинен багълы олса да (15), сычанларда Mfn2нинъ шартлы ёкъ этильмеси оксидленюв фосфорилляциясы (OXthoPHOS) дисфункциясынынъ яхшы танылгъан индукциясыдыр. Нейронларнынъ чешит алт чешитлери (16-19) ве оларнынъ нетиджесинде пейда олгъан нейродегенератив фенотип арекет бозукълыгъы (18, 19) я да мий атаксиясы (16) киби прогрессив неврологик аляметлернен бераберликте ола. Ярлыкъсыз микъдарий (ЯМ) протеомика, метаболомика, тасвирлев ве вирусологик усулларнынъ комбинациясыны къулланып, биз прогрессив нейродегенерация пируват карбоксилаза (ПКх) ве in vivo ПН-лернинъ артериосклерозында иштирак этеджек дигер факторларны кучьлю индукциялагъаныны косьтеремиз Ферментлернинъ ифаделенмеси. Бу тапмаджанынъ актуаллигини тешкермек ичюн биз махсус оларакъ Mfn2 эксиклиги олгъан ПН-лерде PCx экспрессиясыны ашагъы низамладыкъ ве бу амелият оксидатив стрессни агъырлаштыргъаныны ве нейродегенерацияны тезлештиргенини таптыкъ, ве бойлеликнен азооспермия ульке олюмини Метаболизм уйгъунлашувыны бергенини исбатладыкъ. МФН2нинъ агъыр экспрессиясы агъыр ОКСФОС эксиклиги, митохондрия ДНК-сынынъ чокъ истималы ве корюништен сынгъан митохондрия агъынен терминаль дегенерация ПН-ни бутюнлей къуртара биле, бу исе нейродегенерациянынъ бу шекли атта 1990 сенеси хасталыкънынъ инкишаф этюв дереджесинде озь-озюни тюзете биледжегини даа да къайд эте.
Mfn2 нокаут ПН-леринде митохондрияларны корьгезмек ичюн биз Cre-ге багълы митохондрияларгъа сары флюоресцент акъ (YFP) (mtYFP) (20) Cre экспрессиясыны нишангъа алмагъа имкян берген сычан штаммыны къулландыкъ ве in vivo митохондрия морфологиясыны тешкердик. Биз ПН-лерде Mfn2 генининъ ёкъ этильмеси митохондрия агъынынъ яваш-яваш болюнмесине кетиреджегини таптыкъ (S1A рес.), энъ эрте денъишюв исе 3 афталыкъ олгъанда тапылды. Аксине, ПН ульке къатламынынъ муим дегенерациясы, буны Кальбиндин иммунобоялавынынъ гъайып олувы исбатлай, тек 12 афталыкъ олгъанда башланмай (1, А ве В рес.). Митохондрия морфологиясындаки энъ ильк денъишмелер ве нейрон олюмининъ корюнген башланувы арасындаки вакъыт келишмемезлиги бизни ульке олюминден эвель митохондрия дисфункциясы иле башлангъан метаболизм денъишмелерини тешкермеге меджбур этти. Биз YFP (YFP+) экспрессиясы олгъан PN-ни айырмакъ ичюн флюоресценциянен фаальлештирильген улькелерни сыралав (FACS) эсасында стратегия ишлеп чыкътыкъ (1С рес.), ве контроль сычанларда (Mfn2 + / loxP :: mtYFP loxP- stop-loxP: : L7-cre), бундан сонъ CT1BRL (рес.) деп адландырыла. ЙФП сигналынынъ нисбий интенсивлигине эсаслангъан къапу стратегиясынынъ оптималлаштырылмасы бизге ПН-лернинъ ЙФП+ тенини (YFPhigh) ПН олмагъанлардан (YFPneg) (S1B рес.) я да тахминли флюоресцент аксон/дендрит парчачыкъларындан (YFPDright; S1D рес. connfirmed by S1D, confopecal ресими), темизлемеге имкян бере. Тасниф этильген популяциянынъ айнылыгъыны тешкермек ичюн биз LFQ протеомикасыны, сонъра исе эсас компонент талилини кечирдик ве YFPhigh ве YFPneg улькелери арасында ачыкъ айырылма олгъаныны таптыкъ (S1C рес.). YFPhigh улькелери белли PNs маркерлерининъ (яни Calb1, Pcp2, Grid2 ве Itpr3) темиз зенгинлешмесини косьтере (21, 22), амма нейронларда я да башкъа ульке чешитлеринде кенъ таркъалгъан акъсиллернинъ зенгинлешмеси ёкъ (1D рес.) ). Мустакъиль теджрибелерде топлангъан тасниф этильген YFPhigh улькелериндеки нумюнелер арасындаки тенъештирюв корреляция коэффициентини> 0,9 косьтере, бу исе биологик репликалар арасында яхшы текрарланувны косьтере (S1E рес.). Умумен, бу малюматлар имкянлы ПН-ни кескин ве специфик айырмакъ планымызны тасдыкълады. Къулланылгъан L7-cre драйвер системасы догъгъан сонъ биринджи афта ичинде мозаика рекомбинациясыны индюкация эттиги ичюн (23), биз сычанларны CTRL ве шартлы (Mfn2 loxP / loxP :: mtYFP loxP-stop-loxP :: L7-cre) Нейронларны топламагъа башладыкъ. Рекомбинация битти деген сонъ, 4 афталыкъ олгъанда, онъа Mfn2cKO дейлер. Сонъки нокъта оларакъ, биз 8 афталыкъ яшны сечип алдыкъ, о вакъыт ПН къатламы ачыкъ-айдын митохондрия парчачыкъларына бакъмадан, даа сагъ эди (1В рес. ве S1А рес.). Эписи олып, биз джеми оларакъ 3013 акъсилни микъдарджа эсапладыкъ, оларнынъ 22%-ге якъыны митохондрия протеомасына эсаслангъан MitoCarta 2.0 аннотацияларына эсаслангъан эди (1Е рес.) (1Е рес.) (24). 8-нджи афта япылгъан дифференциаль ген экспрессиясы талили бутюн акъсиллернинъ тек 10,5%-де эмиетли денъишмелер олгъаныны косьтере (1Ф рес. ве S1F рес.), олардан 195 акъсил ашагъы, 120 акъсил исе юкъары низамлангъаныны косьтере (1Ф рес.). Бу малюматлар топламынынъ «инновацион ёл талили» дифференциаль экспрессиялангъан генлернинъ эсасен специфик метаболизм ёлларынынъ сынъырлы топламына аит олгъаныны косьтере (1Г рес.). Меракълысы шунда ки, ОКСФОС ве кальций сигнал берювнен багълы ёлларнынъ ашагъы низамланмасы синтез эксиклиги олгъан ПН-лерде митохондрия дисфункциясынынъ индукциясыны тасдыкъласа да, эсасен аминокислота метаболизмини къаплап алгъан башкъа категориялар эмиетли дереджеде юкъарыгъа низамлана, бу исе Р митохрионында пейда олгъан метаболизмге уйгъун келе. Янъыдан теллерни чалыштырув изчендир. дисфункциясы ола.
А) CTRL ве Mfn2cKO сычанларнынъ ПН-лернинъ прогрессив гъайып олувыны косьтерген мийчик кесиклерининъ темсилий конфокаль фоторесимлери (калбиндин, боз); озеклери ДАПИ иле къаршы бояланды. (Б) (А) микъдарыны эсаплав (дисперсиянынъ бир тарафлы талили, ***Р<0,001; учь сычандан n = 4 ден 6 даирегедже). В) Эксперименталь ишнинъ акъымы. Г) Пуркиньеге хас олгъан маркерлернинъ (юкъарыда) ве дигер ульке чешитлерине (ортада) иссилик харитасында даркъалувы. Д) тасниф этильген ПН-де белли олгъан митохондрия акъикъатларынынъ сайысыны косьтерген Венн диаграммасы. Е) 8 афталыкъта Mfn2cKO нейронларында дифференциаль экспрессиялангъан акъикъатларнынъ вулкан графиги (эмиетликнинъ сынъыр дегери 1,3). (Г) Иджадий ёлнынъ талили 8 афта оларакъ тасниф этильген Mfn2cKO ПН-де беш энъ муим юкъары низамланув (къырмызы) ве ашагъы низамланув (мавы) ёлуны косьтере. Эр бир тапылгъан акъсилнинъ орта экспрессия севиеси косьтериле. Боз ренктеки иссилик харитасы: тюзетильген Р къыймети. нс, муим дегиль.
Протеомика малюматлары I, III ве IV комплекслернинъ акъсиллернинъ ифаделенмеси яваш-яваш эксильгенини косьтере. I, III ве IV комплекслернинъ эписинде мтДНК-кодлангъан муим алтбирликлер бар эди, тек ядер кодлангъан II комплекс исе эсас оларакъ тесирленмеген эди (2А рес. ве S2А рес.). . Протеомика нетиджелерине мувафыкъ оларакъ, мийчик токъумаларынынъ кесиклерининъ иммуногистохимиясы ПН-де IV комплекснинъ МТСО1 (митохондрия цитохром С оксидазасынынъ 1-нджи алтбирлиги) алтбирлиги севиеси яваш-яваш эксильгенини косьтере (2В рес.). мтДНК-кодлангъан Mtatp8 алтбирлиги эмиетли дереджеде эксильди (S2A рес.), ядро-кодлангъан АТФ синтаза алтбирлигининъ стабиль севиеси исе денъишмеди, бу исе мтДНК экспрессиясы стабиль олгъанда белли олгъан тургъун АТФ синтаза алтбирлиги F1 комплексине келише. Шекилленюв изчендир. Кесип ташламакъ (7). Сыралангъан Mfn2cKO ПН-лерде мтДНК севиесини акъикъий вакъыттаки полимераз зынджырлы реакциясы (qPCR) ярдымынен къыймет кесюв мтДНК копияларынынъ сайысы яваш-яваш эксильгенини тасдыкълады. Незарет группасынен тенъештирильгенде, 8 афталыкъ олгъанда, мтДНК севиесининъ тек 20%-ге якъыны сакъланып къалды (2С рес.). Бу нетиджелерге мувафыкъ оларакъ, ДНК-ны тапмакъ ичюн Mfn2cKO ПН-лернинъ конфокаль микроскопия боялавы митохондрия нуклеотидлерининъ вакъыткъа багълы сарфыны косьтере (2D рес.). Биз митохондрия акъсиллерининъ деградациясында ве стресс джевабында иштирак этиджи тек базы намзетлернинъ, шу джумледен Lonp1, Afg3l2 ве Clpx, OXPHOS комплекс джыйма факторларынынъ юкъарыгъа низамлангъаныны таптыкъ. Апоптозда иштирак этиджи акъсиллернинъ севиесинде ич бир тюрлю эмиетли денъишмелер тапылмады (С2В рес.). Айны шекильде, биз кальцийнинъ ташылувында иштирак этиджи митохондрия ве эндоплазма сетки каналларында тек уфакъ денъишмелер олгъаныны таптыкъ (С2С рес.). Бундан гъайры, аутофагиянен багълы олгъан акъикъатларнынъ къыймет кесювинде ич бир эмиетли денъишмелер тапылмады, бу исе иммуногистохимия ве электрон микроскопиясы ярдымынен in vivo алда козетильген аутофагосомаларнынъ корюнген индукциясынен келише (S3 рес.). Лякин ПН-лерде прогрессив ОКСФОС дисфункциясы ачыкъ ультраструктур митохондрия денъишмелеринен берабер кече. ве 8 афталыкъ Mfn2cKO ПН-лернинъ ульке джесетлеринде ве дендрит тереклеринде митохондрия кластерлерини корьмек мумкюн, ички зар къурулышы исе терен денъишмелерни кечирди (С4, А ве В рес.). Бу ультраструктур денъишмелерге ве мтДНК-нынъ эмиетли эксильмесине мувафыкъ оларакъ, тетраметилродамин метил эфири (ТМРМ) иле кескин мий мийи дилимлерининъ талили Mfn2cKO ПН-лерде митохондрия мембранасынынъ потенциалы эмиетли дереджеде эксильгенини косьтере (S4C рес.).
А) ОКСФОС комплексининъ ифаде севиесининъ вакъыт кечювини талиль этмек. Тек 8 афталыкъта Р<0,05 олгъан акъсиллерни козь огюне алынъыз (эки тарафлы АНОВА). Нокъталы сызыкъ: CTRL иле тенъештирильгенде, ич бир тюрлю тюзетюв ёкъ. Б) Солда: анти-МТСО1 антителосынен бельгиленген мийчикнинъ кесигининъ мисали (шкала панелинде, 20 мкм). Пуркиндже ульке джисимлери ишгъаль эттиги ер сары тюснен къаплангъан. Сагъда: МТСО1 севиелери микъдарыны эсаплав (дисперсиянынъ бир тарафлы талили; учь сычандан талиль этильген n = 7-ден 20-гедже ульке). В) сыралангъан ПН-де мтДНК копия сайысынынъ кПЦР талили (дисперсиянынъ бир тарафлы талили; n = 3 ден 7 сычангъадже). Г) Солда: ДНК-гъа къаршы антителонен бельгиленген мийчикнинъ мисали (шкала панелинде, 20 мкм). Пуркиндже ульке джисимлери ишгъаль эттиги ер сары тюснен къаплангъан. Сагъда: мтДНК лезияларынынъ микъдарыны эсаплав (дисперсиянынъ бир тарафлы талили; учь сычандан n = 5-тен 9-гъадже ульке). Д) бутюн улькенинъ патч-кламп язувында митоЙФП + Пуркинже улькелерини (окъ) косьтерген кескин мийчик кесикнинъ мисали. Е) IV эгрисининъ микъдарыны бельгилемек. Г) CTRL ве Mfn2cKO Пуркинье улькелеринде деполяризация ток инъекциясынынъ темсилий язмалары. Юкъарыдаки из: АП-ни къозгъагъан биринджи импульс. Ашагъыдаки из: АП-нинъ энъ буюк сыкълыгъы. З) Постсинаптик озь-озюнден киришлернинъ (сПСК) микъдарыны эсаплав. Репрезентатив язув излери ве онынъ масштаблаштырув нисбети (I) ресимде косьтерильген. Дисперсиянынъ бир тарафлы талили учь сычандан n = 5 ден 20 улькегедже талиль этти. Малюматлар орталама±СЭМ оларакъ ифаделенген; *Р<0,05 олгъан; **Р<0,01 олгъан; ***Р<0,001 ола. Дж) тешикли патч-кламп режими ярдымынен язылгъан озь-озюнден пейда олгъан АП-нинъ темсилий излери. Юкъарыдаки из: АП-нинъ энъ буюк сыкълыгъы. Ашагъыдаки из: бир АП-нинъ масштаблаштырылмасы. (К) (Дж) ифадесине коре орта ве энъ буюк АП сыкълыгъыны микъдарджа эсапла. Манн-Уитнининъ тести; Дёрт сычандан n = 5 ульке талиль этильди. Малюматлар орталама±СЭМ оларакъ ифаделенген; муим дегиль.
афталыкъ Mfn2cKO ПН-де ачыкъ-айдын ОКСФОС зарарланувы тапылды, бу исе нейронларнынъ физиологик функциясы пек аномаль олгъаныны косьтере. Шунынъ ичюн биз 4-5 афталыкъта ве 7-8 афталыкъта ОКСФОС эксиклиги олгъан нейронларнынъ пассив электрик хусусиетлерини кескин мий дилимлеринде бутюн ульке патч-кламп язувларыны япып талиль эттик (2Е рес.). Бекленильмеген алда, Mfn2cKO нейронларынынъ орта раатланув мембраналы потенциалы ве кириш къаршылыгъы контрольге бенъзей эди, амма улькелер арасында индже фаркълар бар эди (1 табл.). Айны шекильде, 4— 5 афталыкъ олгъанда, ток-кергинлик мунасебетинде (IV эгри) ич бир тюрлю эмиетли денъишмелер тапылмады (2Ф рес.). Лякин 7-8 афталыкъ ич бир Mfn2cKO нейроны IV режимден (гиперполяризация адымы) сагъ къалмады, бу кеч басамакъта гиперполяризация потенциалына ачыкъ сезиджилик олгъаныны косьтере. Аксине, Mfn2cKO нейронларында текрарлангъан арекет потенциалы (АП) бошатылувларына себеп олгъан деполяризация акъынтылары яхшы кечириле, бу исе оларнынъ умумий бошатылув шекиллери 8 афталыкъ идаре нейронларындан ич де фаркъланмагъаныны косьтере (1 табл. ве 2Г рес.). Айны шекильде, озь-озюнден пейда олгъан постсинаптик акъынтыларнынъ (сПСК) сыкълыгъы ве амплитудасы идаре группасынынъ сыкълыгъынен тенъештирильди, вакъиаларнынъ сыкълыгъы 4 афтадан 5 афтагъадже 7 ​​афтадан 8 афтагъадже бойле артувнен артты (2 рес., Н ве I). ПН-лерде синаптик пишкинлешюв деври (25). Бунъа бенъзеген нетиджелер тешикли ПНс ямаларындан сонъ да эльде этильди. Бу конфигурация бутюн ульке патч-кламп язувында ола бильгени киби, ульке АТФ къусурларынынъ мумкюн олгъан компенсациясына маниа ола. Хусусан, Mfn2cKO нейронларынынъ раатланув мембран потенциалына ве озь-озюнден атув сыкълыгъына тесир этмеди (2 рес., J ве K). Умумен, бу нетиджелер ачыкъ-айдын ОКСФОС дисфункциясы олгъан ПН-лер юксек частоталы разряд шекиллерини яхшы кечип оладжагъыны косьтере, бу исе оларгъа якъын нормаль электрофизиологик джевапларны сакълап къалмагъа имкян берген компенсация механизми олгъаныны косьтере.
Малюматлар орталама ± СЭМ (дисперсиянынъ бир тарафлы талили, Холм-Сидакнынъ чокъ къыяслав тести; *Р<0,05) оларакъ ифаделенген. Бирлемнинъ ракъамы къавуслар ичинде косьтериле.
Биз протеомика малюмат топламында (1Г рес.) эр бир категорияда агъыр ОКСФОС эксиклигине къаршы чыкъа бильген ёллар олгъаныны тешкермеге ёлгъа чыкътыкъ, ве бунынънен зарарлангъан ПН не ичюн якъын нормаль электрофизиологияны сакълап оладжагъыны анълаттыкъ (2 рес., Е-ден К-гедже). . Протеомик талиль тармакълы зынджырлы аминокислоталарнынъ (БЗАА) катаболизминде иштирак этиджи ферментлернинъ эмиетли дереджеде юкъарыгъа низамлангъаныны косьтере (3А рес. ве S5А рес.), сонъки махсулат атсетил-КоА (СоА) я да сукцинил КоА артериосклерозда (артериосклерозда) трикарбоксилатларны толдура биле. Биз ВСАА трансаминаза 1 (ВСАТ1) ве ВСАТ2нинъ микъдарынынъ экиси де арткъаныны таптыкъ. Олар α-кетоглутараттан глутамат мейдангъа кетирмек ёлунен ВСАА катаболизмининъ биринджи адымыны катализлей эдилер (26). Тармакълы зынджырлы кетокислота дегидрогеназа (БККД) комплексини тешкиль этмек ичюн бутюн алт бирлемлер юкъарыгъа низамлана (комплекс пейда олгъан ВСАА карбон скелетининъ сонъки ве къайтарылмаз декарбоксилляциясыны катализлей) (3А рес. ве S5А рес.). Лякин сыралангъан ПН-де ВСАА-нынъ озюнде ачыкъ-айдын денъишмелер тапылмады, бу исе бу зарур аминокислота-ларнынъ улькелерге зияде алынмасы я да ТСА девирини толдурмакъ ичюн башкъа менбалар (глюкоза я да сют экшилиги) къулланылмасынен багълы ола биле (С5В рес.). ОКСФОС етишмеген ПН-лерде де 8 афталыкъ олгъанда глутаминнинъ парчаланувы ве трансаминация фаалиетининъ арткъаныны косьтере, буны митохондрия ферментлери глутаминаза (ГЛС) ве глутамин пируват трансаминаза 2 (ГПТ2) юксельтильмесинен акс этмек мумкюн (3, А ве С рес.). Къайд этмеге ляйыкътыр ки, ГЛСнинъ юксельтильмеси тек сплайслангъан изоформа глутаминаза С (ГЛС-ГАС) иле сынъырлана (Mfn2cKO/CTRL денъишмеси тахминен 4,5 кере, Р = 0,05), онынъ рак токъумаларында специфик юксельтильмеси исе Митонергионрияны дестеклей биле. (27) ола.
А) Сыджакълыкъ харитасында 8 афталыкъта белли бир ёл ичюн акъсиллернинъ севиесининъ къат денъишмеси косьтериле. Б) анти-ПКх антителосынен бельгиленген мийчикнинъ мисали (шкала панелинде, 20 мкм). Сары окъ Пуркиндже улькеси джесетини косьтере. В) Атеросклерознынъ муим намзети оларакъ белли этильген вакъыт кечювиндеки акъсиллернинъ экспрессиясы талили (чокъ t-тест, *FDR <5%; n = 3-5 сычан). Г) Юкъарыда: [1-13С]пируват излейиджисиндеки бельгиленген углеродкъа кирмекнинъ чешит ёлларыны косьтерген схематик схема (яни ПДГ я да трансартериаль ёлнен). Ашагъыда: Кемане диаграммасында кескин мий дилимлерини [1-13С]пируватнен бельгилеген сонъ аспартат экшилигине, лимон экшилигине ве алма экшилигине чевирильген бир бельгиленген углероднынъ (М1) фаизи косьтериле (чифт t-тест; ** Р <0,01). Д) Кёрсетильген ёлнынъ эр тарафлама вакъыт тарихы талили. Тек 8 афталыкъта Р<0,05 олгъан акъсиллерни козь огюне алынъыз . Кесик сызыкъ: ич бир тюрлю тюзетюв къыймети ёкъ (дисперсиянынъ эки тарафлы талили; * Р <0,05; *** Р <0,001). Малюматлар орталама±СЭМ шеклинде ифаделенген.
Бизим талильде ВСАА катаболизми юксельтювнинъ эсас ёлларындан бири олды. Бу факт ТСА девирине кирген вентиляция колеми ОКСФОС олмагъан ПН-де денъише биледжегини къатты тасдикълай. Бу нейронларнынъ метаболизмини янъыдан теллернен багълавнынъ эсас шекилини ифаде эте биле, бу исе агъыр ОКСФОС дисфункциясыны девам эттирюв вакътында нейронларнынъ физиологиясына ве сагъ къалувына догърудан-догъру тесир эте биле. Бу гипотезагъа мувафыкъ оларакъ, биз атеросклеротикке къаршы эсас фермент PCx юкъарыгъа низамлангъаныны таптыкъ (Mfn2cKO/CTRL тахминен 1,5 кере денъише; 3А рес.), бу пируватнынъ оксалоацетаткъа чевирильмесини катализлей (28), бу исе тиссуцита экспрессиясы а9,2000 сенеси олгъанына ишаныла. 30). Протеомика нетиджелерине мувафыкъ оларакъ, конфокаль микроскопия ОКСФОС эксиклиги олгъан ПН-лерде ПКх экспрессиясы специфик ве эмиетли дереджеде арткъаныны, ПКх реактивлиги исе эсасен контрольнинъ янындаки Бергман глиаль укюретлеринен сынъырлангъаныны косьтере (3В рес.). ПКхнинъ козьде тутулгъан юксельтильмесини функциональ сынамакъ ичюн биз кескин мий дилимлерини [1-13С]пируват излейиджисинен ишледик. Пируват пируватдегидрогеназа (ПДГ) ярдымынен оксидленгенде, онынъ изотоп ярлыгъы гъайып олды , Амма пируват къан дамарлары реакциялары ярдымынен метаболизмге кечкенде, ТСА девирининъ ара мадделерине кирсетиле (3D рес.). Бизим протеомик малюматларымызны тасдикъламакъ ичюн, биз Mfn2cKO дилимлерининъ аспартат экшилигинде бу излейиджиден чокъ сайыда маркерлерни козьде туттыкъ, лимон экшилиги ве алма экшилиги де, эмиетли олмаса да, орта тенденциягъа малик эди (3D рес.).
МитоПарк сычанларнынъ дофамин нейронларында митохондрия транскрипция факторы А генини (Тфам) махсус ёкъ этмек себебинден пейда олгъан митохондрия дисфункциясы олгъан дофамин нейронларында (S6B рес.) PCx экспрессиясы да эмиетли дереджеде юксельген низамлангъан эди (31), бу исе атсетон кислота дисфункциясы дисфункциясы дисфункциясынынъ дисфункциясы олгъаныны косьтере. ОКСФОС организмде. Къайд этмеге ляйыкътыр ки, артериосклерознен багълы ола бильген нейронларда ифаделене бильген уникаль ферментлер (32-34) ОКСФОС етишмеген ПН-лерде эмиетли дереджеде юксельтильгени тапылгъан, меселя, пропионил-КоА карбоксилаза (ПСК-А), Малонил-КоА митрило-КоА пропионил-КоА-ны пропионил-КоА-гъа чевире. ферменти (МЭ3), онынъ эсас вазифеси малаттан пируватны къайтармакътыр (3 рес., А ве С) (33, 35). Бундан гъайры, биз ПДГ-ни фосфориллеген ве бойлеликнен инактивация япкъан Pdk3 ферментининъ эмиетли артувыны таптыкъ (36), ПДГ-ни активлештирген Pdp1 ферментинде я да ПДГ фермент комплексининъ озюнде денъишмелер тапылмады (3А рес.). Девамлы оларакъ, Mern2cKO ПН-лерде Ser293-теки ПДГ комплексининъ пируватдегидрогеназа Е1 компонентининъ α1 алтбирлиги α (PDHE1α) алтбирлигининъ фосфорилляциясы къуветленди (ПДГ фермент фаалиетини ингибирлегени белли) ( S6C рес.) (S6C рес.). Пируватнынъ дамарларгъа иришмеси ёкъ.
Ниает, биз серин ве глицин биосинтезининъ супер ёлу, онен багълы митохондрия фолат (1С) деври ве пролин биосинтези (1Г рес. ве S5С рес.) эписи, хаберлерге коре, активация джерьянында эмиетли дереджеде юкъарыгъа низамлангъаныны таптыкъ. Этрафтаки токъумалар митохондриянынъ дисфункциясынен фаальлеше (5-7). Бу протеомик малюматларны тасдикълагъан конфокаль талиль OXPHOS етишмеген ПН-де 8 афталыкъ сычанларнынъ мий дилимлери митохондрия фолат девирининъ эсас ферменти олгъан серин гидроксиметилтрансфераза 2 (SHMT2) иле огъратылгъаныны косьтере. Эм иммун джевабы эмиетли (С5Д рес.). CU-глюкоза иле инкубация этильген кескин мийчик дилимлеринде метаболизм излев теджрибелери серин ве пролин биосинтезининъ юкъарыгъа низамланувыны даа да тасдыкълады, бу исе серин ве пролинге углерод изоформларынынъ акъымы арткъаныны косьтере (S5E рес.). ГЛС ве ГПТ2 тарафындан тешвикъат этильген реакциялар глутаминден глутаматнынъ синтези ве глутамат ве α-кетоглутарат арасындаки трансаминация ичюн месуль олгъанындан, оларнынъ юксельтильмеси ОКСФОС эксиклиги олгъан нейронларда глутаматкъа олгъан талапнынъ арткъаныны косьтере , Бу, Стаурелиннинъ арткъан биосинтезини сакълап къалмагъа ёнельген ола биле5. Бу денъишмелерден фаркълы оларакъ, PN-специфик Mfn2cKO сычанларындан алынгъан мийчик астроцитлерининъ протеомик талили бу ёллар (оларнынъ арасында бутюн антипероксидазалар) экспрессияда эмиетли денъишмегенини косьтере, ве бойлеликнен, Бу метаболизмнинъ гъайрыдан ёнелишини деградациялангъан PN-ге D-ге селектив олгъаныны косьтере (S6 рес., G-ге).
Умумен, бу анализлер ПН-лерде специфик метаболизм ёлларынынъ вакъыт джеэтинден фаальлешмесининъ эмиетли дереджеде чешит шекиллерини ачыкълады. Нейрон митохондрияларынынъ аномаль функциясы эрте атеросклерозгъа ве 1С ремоделированиесине (3Е рес. ве S5С рес.), атта I ве IV комплекслернинъ ифаделенювинде огюнде айтыла бильген денъишмелерге кетире бильсе де, серин де ново синтезиндеки денъишмелер тек О, тек кеч стадияларда корюнди. ОКСФОС дисфункциясы (3Е рес. ве С5С рес.). Бу тапмаджалар стресс иле пейда олгъан митохондрия (1С девир) ве цитоплазма (серин биосинтези) нейронларнынъ метаболизмини янъыдан шекиллендирмек ичюн ТСА девиринде атеросклерознынъ артмасынен синергик джевап берген сыралы джерьянны бельгилейлер.
афталыкъ ОКСФОС эксиклиги олгъан ПН юксек частота къозгъалыш фаалиетини сакълап ола ве митохондрия дисфункциясыны компенсацияламакъ ичюн эмиетли метаболизмнинъ янъыдан багъланувыны кече биле. Бу кешфият меракълы бир ихтималны догъура ки, бу дакъкъасында биле бу улькелер нейродегенерацияны кечиктирмек я да онынъ огюне кечмек ичюн терапевтик къарышувны да ала билелер. Кеч. Биз бу имкянны эки мустакъиль къарышув ярдымынен чездик. Биринджи усулда биз Cre-ге багълы адено-ассоциированный вирус (ААВ) векторыны ойле уйдурдыкъ ки, MFN2 in vivo OXPHOS-эксиклиги олгъан ПН-лерде сечип алынмакъ мумкюн (S7А рес.). МФН2-ни кодлагъан ААВ ве mCherry флюоресцент репортер гени (Mfn2-AAV) биринджи нейрон культураларында in vitro тасдыкъланды, бу исе МФН2-нинъ Cre-ге багълы шекильде ифаделенмесине себеп олды ве митохондрия морфологиясыны къуртарды, ве бунынънен Mfns нейронында нейромутациянынъ огюне кечти, D Figure, E S7). Сонъра биз 8 афталыкъ Mfn2-AAV-ни Mfn2cKO ве контроль сычанларнынъ мий къабугъына стереотактик ёлнен еткизмек ичюн in vivo теджрибелери кечирдик ве 12 афталыкъ сычанларны талиль эттик (4А рес.). Ишленген Mfn2cKO сычанлары ольдилер (1 рес., А ве В) (16). In vivo вирус трансдукциясы базы мийчик даирелеринде ПНнинъ селектив экспрессиясына кетире (S7, G ве H рес.). Тек mCherry (Ctrl-AAV) ифаделеген контроль ААВ инъекциясы Mfn2cKO айванларында нейродегенерация дереджесине ич бир тюрлю эмиетли тесир этмеди. Аксине, Mfn2-AAV иле трансдукциялангъан Mfn2cKO-ларнынъ талили ПН ульке къатламынынъ эмиетли къорчалав тесирини косьтере (4 рес., В ве С). Хусусан, нейронларнынъ сыкълыгъы идаре айванларындан деерлик айырылмаз киби корюне (4 рес., В ве С, ве S7, Н ве I рес.). МФН1нинъ ифаделенмеси, амма МФН2нинъ дегиль де, нейронларнынъ олюмини къуртарувда айны дереджеде тесирлидир (4С рес. ве S7, С ве Ф ресимлери), бу исе эктопик МФН1нинъ ифаделенмеси МФН2нинъ эксиклигини эффектив шекильде толдура биледжегини косьтере. Ялынъыз ПН севиесиндеки илеридеки талиль Mfn2-AAV митохондрияларнынъ ультраструктурасыны буюк дереджеде къуртаргъаныны, мтДНК севиелерини нормаллештиргенини ве ангиогенезге къаршы маркер PCx юксек экспрессиясыны терсине чевиргенини косьтере (4 рес., С дан Е ). Къуртарылгъан Mfn2cKO сычанларыны раатлыкъ вазиетинде козьнен тешкерюв оларнынъ туруш ве арекет аляметлери (S1-ден S3-кедже арекет) яхшылашкъаныны косьтере. Нетиджеде, бу теджрибелер, ОКСФОС-та агъыр эксиклик олгъан ПН-лерге МФН2-нинъ кечиктирильген гъайрыдан кирсетильмеси мтДНК истималыны терсине чевирмек ве атеросклерозны къозгъамакъ ичюн етерли олгъаныны косьтере, ве бунынънен in vivo аксонларнынъ дегенерациясы ве нейронларнынъ олюмининъ огюне кече.
А) косьтерильген метаболизм ёлу фаальлештирильгенде, МФН2 кодлагъан ААВ инъекциясы ичюн эксперименталь джедвелни косьтерген схема. Б) 8 афталыкъта Mfn2cKO сычанларынен трансдукция этильген ве анти-Кальбиндин антителосынен бельгиленген 12 афталыкъ мийчик кесиклерининъ темсилий конфокаль фоторесимлери. Сагъда: аксон лифлерининъ ольчюси. Аксон зумынынъ ольчюси 450 ве 75 мкм. В) Солда: ААВ трансдукция иллемесинде (ААВ+) Пуркинже ульке сыкълыгъынынъ микъдарыны эсаплав (дисперсиянынъ бир тарафлы талили; n = 3 сычан). Сагъда: 12-нджи афта трансдукциялангъан ПН-де мтДНК фокус анализи (чифтсиз t-тест; учь сычандан n = 6 ульке). * Р <0,05; ** Р <0,01 ола. Г) косьтерильген вирус векторларынен трансдукциялангъан Mfn2cKO мийчик кесиклерининъ ПН-лерининъ темсилий ёлланув электрон микрографиялары. Гульдестени маска дендритлернинъ ишгъаль эттиги ерни, сары нокъталы квадрат исе сагъ тарафта берильген масштабны косьтере; n — озекни бильдире. Шкала панелинде, 1мкм. (Е) 12 афталыкъта трансдукциялангъан ПН-де ПКх бояланувынынъ мисали косьтерильген. Шкала панелинде, 20мкм. ОЭ, зияде ифаде этмек; ФК, къат денъиштирмек.
Ниает, биз ОКСФОС дисфункциясыны кечирген ПН-лерде пероксидаза иле мейдангъа кельген улькелернинъ сагъ къалувынынъ эмиетини тешкердик. Биз махсус сычан PCx мРНК-сына (AAV-shPCx) нишанлангъан AAV-shRNA (къыскъа шпилька РНК) кодлайыджы mCherry генерация эттик ве Mfn2cKO сычанларнынъ мийине вирусны я да онынъ скрамблированный контрольини (AAV-scr) инъекция эттик. Инъекция дёртюнджи афталыкъта япылды (5А рес.), ПКх экспрессиясы арткъан (3С рес.) ве ПН ульке къатламы даа сагълам олгъан девирде эффектив ПКх нокдаунына иришмек ичюн (1А рес.). Шуны къайд этмек керек ки, ПКх-ни йыкъмакъ (С8А рес.) ПН олюмининъ эмиетли тезлешмесине кетире, бу исе инфекциянынъ екяне сынъырлангъан алкъасыдыр (5, В ве С рес.). ПКх юксельтильмеси иле индюкация этильген метаболизм тесирлерининъ механизмини анъламакъ ичюн, биз ПКх нокдаунындан сонъ ПН-лернинъ редокс статусыны огрендик ве ААВ вастасынен оптик биосенсор Grx1-roGFP2 айны вакъытта экспрессияланды (S8 рес., В-дан D-гедже) глутатион потенциалнинъ глутатион3 къыймет кесмек ичюн. Сонъра, биз 7 афталыкъ Mfn2cKO я да контроль литерматларнынъ кескин мий дилимлеринде эки фотонлы флюоресцент омюр тасвирлев микроскопиясыны (FLIM) яптыкъ, FLIM шараитлерини тешкерген сонъ цитоплазма редокс статусында ола бильген денъишмелерни тапмакъ ичюн (S8 рес., E ден G гедже). Талиль PCx экспрессиясы олмагъан бир Mfn2cKO ПН-нинъ оксидленюв вазиетининъ эмиетли арткъаныны косьтере, бу исе идаре нейронларындан я да тек скремблленген шРНК экспрессиясы олгъан Mfn2cKO ПН-леринден фаркъ эте (5 рес., D ве E). PCx экспрессиясы ашагъы низамлангъанда, юксек оксидленген алны косьтерген Mfn2cKO ПН-лернинъ фаизи учь кереден зияде артты (5Е рес.), бу исе PCx юкъары низамлангъаны дегенерациялангъан нейронларнынъ оксид-къайта тикленюв къабилиетини сакълап къалгъаныны косьтере.
А) косьтерильген метаболизм ёлу фаальлештирильгенде shPCx кодлагъан ААВ инъекциясы ичюн эксперименталь джедвелни косьтерген схема. Б) 4 афталыкъта трансдукциялангъан ве антикальциневин антителосынен бельгиленген Mfn2cKO сычанларында 8 афталыкъ мийчик кесиклерининъ темсилий конфокаль фоторесимлери. Шкала панелинде, 450мкм. В) ААВ-трансдукциялангъан иллелерде Пуркинже ульке сыкълыгъынынъ микъдарыны эсаплав (дисперсиянынъ бир тарафлы талили; n = 3 ден 4 сычангъадже). Малюматлар орталама±СЭМ оларакъ ифаделенген; ***Р<0,001 ола. Г) Репрезентатив ФЛИМ ресиминде 7 афталыкъ ПН-нинъ глутатион редокс сенсоры Grx1-roGFP2 ифаделенген орта омюр муддети косьтерильген эксперименталь шараитлерде косьтериле. ЛУТ (къыдырув джедвели) нисбети: сагъ къалув вакъты аралыгъы (пикосекундларда). Шкала панелинде, 25мкм. (Д) Гистограммада Grx1-roGFP2 омюр дегерлерининъ (D) дан пайлашмасы косьтериле (эр бир шартта эки сычанда n=158 ден 368 улькегедже). Эр бир гистограмманынъ устюндеки пай диаграммасы: CTRL-AAV-scr ольчюсиндеки орта омюр дегерининъ 1 СД-ден зияде олгъан омюр муддети эппейи узун (къырмызы, оксидленген) я да къыскъа (мавы, эксильген) къыйметлери олгъан улькелернинъ сайысыны косьтере. Е) Теклиф этильген модель нейрон ПКх-нинъ юксельтильмесининъ къорчалав тесирини косьтере.
Эписи олып, биз мында берген малюматлар, МФН2нинъ янъыдан экспрессиясы агъыр ОКСФОС эксиклиги, агъыр мтДНК эксильмеси ве сонъ дередже аномаль истагъа бенъзеген морфологиясы олгъан инкишафлы ПН-ни бутюнлей къуртара биледжегини косьтере ве бунынънен атта инкишафлы хасталыкъларда да токътамайып илерилевни темин эте биле. Нейродегенерация улькенинъ олюминден эвельки басамакънынъ кери къайтарыла бильген делиллерини бере. Метаболизмнинъ бу дереджесини нейронларнынъ атеросклерозны (ТСА девирининъ янъыдан теллендирювини) къозгъамакъ къабилиети даа да айдынлата, бу исе ОКСФОС етишмеген ПН-лерде ПКх экспрессиясыны ингибирлей ве улькенинъ олюмини къуветлештире, ве бунынънен къорчалав ролюни ойнай (5Ф рес.).
Бу тедкъикъатта биз ПН-лернинъ ОКСФОС дисфункциясына джевабы метаболизм программалары тарафындан активлештирильген дифференциаль активация ёлу вастасынен яваш-яваш ТСА девирининъ атеросклерозына якъынлашмакъ олгъанына делиллер кетирдик. Биз протеомик анализни бир чокъ тамамлайыджы усулларнен тасдыкъладыкъ ве агъыр митохондрия дисфункциясы иле сынавгъа огърагъанда нейронларнынъ метаболизм эластиклигининъ эвельден белли олмагъан шекили олгъаныны ачыкъладыкъ. Бизни тааджиплендирген шей шунда ки, бутюн янъыдан теллерни багълав джерьяны нейродегенерациягъа яваш-яваш ве къайтарып оламагъан шекильде ёлдашлыкъ япкъан сонъки метаболизм алыны ич де къайд этмей, амма бизим малюматларымыз о, атта улькенинъ олюминден эвельки басамакъта биле девамлы нейронны тешкиль эте биледжегини косьтере Функциональ компенсация механизми. Бу тапмаджа нейронларнынъ организмде баягъы дереджеде метаболизм пластичности олгъаныны косьтере. Бу факт МФН2-нинъ сонърадан янъыдан кирсетильмеси эсас метаболизм маркерлерининъ экспрессиясыны терсине чевире ве ПН дегенерациясынынъ огюне кече биледжегини исбатлай. Аксине, атеросклерозны ингибирлей ве нерваларны тезлештире. транссексуал ола.
Бизим араштырмамызда энъ меракълы тапмаджалардан бири шунда ки, ОКСФОС олмагъан ПН-лер артериосклерозны махсус тешвикъат этеджек юксельтиджи ферментлер ярдымынен ТСА девирининъ метаболизмини денъиштире билелер. Метаболизмнинъ янъыдан ерлештирильмеси рак укюретлерининъ умумий хусусиетидир, оларнынъ базылары нефес алув зынджырыны идаре этеджек ве липид ве нуклеотид биосинтезининъ прекурсорларынынъ мейдангъа кетирильмесини девам эттирген редуцирлейиджи эквивалентлерни мейдангъа кетирмек ичюн ТСА девирининъ ара мадделерини толдурмакъ ичюн глутаминге таяналар (39 , 40). Якъында япылгъан бир араштырма ОКСФОС дисфункциясыны кечирген периферик токъумаларда глутамин/глутамат метаболизмининъ янъыдан багъланмасы да козьге чарпкъан хусусиет олгъаныны косьтере (5, 41), мында глутаминнинъ ТСА девирине кирюв ёнелиши ОКСФОС зарарланувынынъ агъырлыгъы себебинден багълыдыр (41). ). Лякин организмде нейрон метаболизм пластикасынынъ эр анги бир бенъзешмеси ве онынъ хасталыкъ контекстиндеки ола бильген актуаллиги акъкъында ачыкъ делиллер ёкъ. Якъында кечирильген in vitro теткъикъатында биринджи кортикаль нейронлар нейротрансмиссия ичюн глутамат пулларыны сефербер этелер, ве бунынънен метаболизм стресс шараитлеринде оксидатив метаболизм ве атеросклерозгъа ярдым этелер (42). Шуны къайд этмек керек ки, ТСА девирининъ сукцинатдегидрогеназа ферментининъ фармакологик ингибиторлыгъы алтында пируват карбоксилляциясы осюмлик мийчик гранула нейронларында оксалоацетатнынъ синтезини девам эте, деп саялар (34). Лякин бу механизмлернинъ мий токъумасына (анда атеросклероз эсасен астроцитлернен сынъырлангъаны тюшюниле) физиологик эмиети даа муим физиологик эмиетке маликтир (43). Бу вазиетте бизим малюматларымыз организмде ОКСФОС иле зарарлангъан ПН-лерни ВСАА деградациясына ве пируват карбоксилляциясына кечирмек мумкюн олгъаныны косьтере, олар ТСА пул ара мадделерининъ толдурувынынъ эки эсас менбасыдыр. ВСАА катаболизмининъ нейрон энергиясы метаболизмине къошкъан тахминли иссеси теклиф этильсе де, нейротрансмиссия ичюн глутамат ве ГАМК ролюнден гъайры (44), бу механизмлернинъ in vivo тарзында даа ич бир делиль ёкъ. Шунынъ ичюн дисфункциональ ПН-лер атеросклерозны арттырув иле ассимиляция джерьяны тарафындан идаре этильген ТСА ара мадделернинъ истималыны автоматик суретте компенсация эте биледжегини тахмин этмек къолай. Хусусан, аспартат экшилигине олгъан талапнынъ арткъаныны сакълап къалмакъ ичюн ПКхнинъ юксельтильмеси керек ола биле, бу митохондрия дисфункциясы олгъан пролифератив улькелерде косьтерильди (45). Лякин бизим метаболомик талильимиз Mfn2cKO ПН-лерде аспартат экшилигининъ стабиль севиесинде ич бир тюрлю эмиетли денъишмелерни косьтермеди (S6А рес.), бу, тахминен, пролифератив улькелер ве митоздан сонъки нейронлар арасында аспартат экшилигининъ чешит метаболизм истималыны акс эте . In vivo дисфункциональ нейронларда PCx юксельтильмесининъ догъру механизми характеристика берильмеген олса да, биз бу эрте джевап нейронларнынъ редокс алыны сакълап къалувда муим роль ойнагъаныны косьтере эдик, буны мий дилимлери узеринде япылгъан FLIM теджрибелеринде косьтердик. Хусусан, ПН-лернинъ ПКх-ни юксельтювине маниа олмакъ даа зияде оксидленген алгъа кетире ве улькенинъ олюмини тезлештире биле. ВСАА деградациясынынъ активлешмеси ве пируватнынъ карбоксилленмеси митохондрия дисфункциясынынъ периферик токъумаларыны характеризлемекнинъ ёллары дегиль (7). Демек, олар нейродегенерация ичюн муим олгъан тек бир хусусиет олмаса биле, ОКСФОС эксиклиги олгъан нейронларнынъ огде тургъан хусусиети олып корюнелер. .
Мий хасталыгъы — нейродегенератив хасталыкънынъ гетероген чешитидир, о, адет узьре атаксия шеклинде озюни косьтере ве ПН-лерни сыкъ-сыкъ зарарлай (46). Бу нейрон популяциясы митохондрия дисфункциясына айрыджа зарарлыдыр, чюнки оларнынъ сычанларда селектив дегенерациясы инсан спиноцеребелляр атаксиясыны хас олгъан бир чокъ арекет аляметлерини текрарламакъ ичюн етерлидир (16, 47, 48). Хаберлерге коре, мутант генли трансген сычан модели инсан спиноцеребелляр атаксиясынен багълы ве митохондрия дисфункциясына маликтир (49, 50), бу исе ПНПХ-де ОКСФОС эксиклигининъ нетиджелерини огренмекнинъ муимлигини къайд эте. Шунынъ ичюн бу уникаль нейрон популяциясыны семерели айырмакъ ве огренмек айрыджа келише. Лякин ПН-лернинъ басымгъа пек сезиджи олгъаныны ве бутюн мийчик улькелери популяциясынынъ алчакъ къысмыны тешкиль этмесини козь огюне алгъанда, омик эсасында япылгъан бир чокъ араштырмалар ичюн оларны бутюн улькелер оларакъ сечип алмакъ даа къыйын тарафтыр. Дигер ульке тюрлерининъ (хусусан буюклернинъ токъумаларынынъ) мутлакъ ифраз этильмесине иришмек деерлик мумкюн олмаса да, биз ашагъы акъынты протеомика анализи ичюн етерли сайыда омюрге къабилиетли нейронлар эльде этмек ичюн ФАКС иле эффектив диссоциация адымыны бирлештирдик, ве биз гъает юксек акъсил къапламасы бар (тахминен 3000 the cerebel with (51) ола. Бутюн улькелернинъ яшайыш къабилиетини сакълап, биз мында кетирген усул тек митохондриялардаки метаболизм ёлларындаки денъишмелерни тешкермеге дегиль де, онынъ цитоплазма аналогларындаки денъишмелерни де тешкермеге имкян бере, бу исе митохондрия зар ярлыгъыны зенгинлештирювнинъ къулланувыны толдура, бу исе улькелернинъ митохондрия тюрлерине хас олгъан митохондрия зарларынынъ зенгинлештирювини толдура. (52, 53) ола. Биз тасвирлеген усул тек Пуркинье улькелерини огренювнен багълы дегиль, хаста мийлердеки метаболизм денъишмелерини, шу джумледен митохондрия дисфункциясынынъ башкъа моделлерини чезмек ичюн эр бир ульке чешитине къолайлыкънен къулланмакъ мумкюн.
Ниает, биз бу метаболизмнинъ янъыдан ерлештирильмеси джерьянында ульке стрессининъ эсас аляметлерини бутюнлей терсине чевире бильген ве нейронларнынъ дегенерациясынынъ огюне кече бильген терапевтик пенджерени бельгиледик. Демек, мында тасвирленген янъыдан теллерни багълавнынъ функциональ нетиджелерини анъламакъ митохондрия дисфункциясы вакътында нейронларнынъ яшайыш къабилиетини сакълап къалмакъ ичюн мумкюн олгъан тедавийлевлер акъкъында эсас малюматлар бере биле. Бу принципнинъ башкъа неврологик хасталыкъларгъа да къулланылмасыны толусынен ачыкъламакъ ичюн, мийнинъ башкъа укюрет чешитлеринде энергия алмашувындаки денъишмелерни дискретлештирмеге ёнельген келеджек араштырмалар керек.
МитоПарк сычанлары акъкъында эвель де айтылгъан эди (31). loxP фланкировкалы Mfn2 генлери олгъан C57BL/6N сычанлары эвельден тасвирленген эди (18) ве L7-Cre сычанларынен къарыштырылгъан эди (23). Сонъра алынгъан эки гетерозигот эвлятлар гомозигот Mfn2loxP/Mfn2loxP сычанларынен къарыштырылды ве Mfn2 ичюн Пуркинжеге хас ген нокаутлары мейдангъа кетирильди (Mfn2loxP/Mfn2loxP; L7-cre). Чифтлешювнинъ бир алт группасында Gt (ROSA26) SorStop-мито-YFP аллели (stop-mtYFP) къошма хачлар ярдымынен кирсетильди (20). Айванларгъа япылгъан бутюн процедуралар Авропа, миллий ве институциональ ёлбашчылыкъкъа коре япылды ве Алманиянынъ Шималий Рейн-Вестфалия шеэрлериндеки Умвелт ве Verbraucherschutz шеэрлериндеки LandesamtfürNatur тарафындан тасдикъланды. Айванлар узериндеки иш де Авропа лаборатория айванлары акъкъында илимлер бирлешмелери федерациясынынъ ёлбашчылыгъына риает эте.
Юклю къадыннынъ бойну чыкъкъан ерини наркозгъа къойгъан сонъ, сычан эмбрионы айырыла (Е13). Кортекс 10 мМ Гепес къошулгъан Хэнкснинъ мувазенели туз иляджында (ХБСС) дискретлештирильди ве теркибинде папаин (20 Е/мл) ве цистеин (1 мкг/мл) олгъан Дульбекконынъ Модификациялангъан Къартал ортасына кечирильди. Токъуманы ДМЭМ-де инкубация этелер) ве ферментли азырлав ёлунен диссоциация этелер. Мл) 37°С температурада 20 дакъкъа девамында, сонъра 10% дёгме сыгъыр къан плазмасына къошулгъан ДМЭМде механик ёлнен дигерлендириле. см культура савутына 2×106 сыкълыкъта я да тасвирлев анализи ичюн 0,5×105 ульке/см2 сыкълыкъта полилизиннен къаплангъан джам къаплама листлерине улькелер экильди. сааттан сонъ орталыкъны 1% В27 къошмасы ве 0,5 мМ GlutaMax олгъан Neurobasal къан плазмасыз орталыкънен денъиштирдилер. Сонъра нейронлар бутюн денъев девамында 37°С ве 5% СО2 температурада тутулдылар, афтада бир кере беслендилер. Рекомбинацияны in vitro индюкация этмек ичюн, in vitro экинджи куню нейронларны тедавийлемек ичюн 3 мкл (24 лункалы культура савуты) я да 0,5 мкл (24 лункалы пластинка) ашагъыдаки AAV9 вирус векторы къулланылды: AAV9.CMV.PI.eGFP. WPRE.bGH (Къошма, каталог номерасы 105530-ААВ9) ве ААВ9.CMV.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40 (Къошма, каталог номерасы 105545-ААВ9).
Сычан Mfn1 ве Mfn2 комплементар ДНК-сы (Addgene плазмидаларындан #23212 ве #23213 эльде этильген) С-узьюнде V5 сырасынен (GKPIPNPLLGLDST) бельгилене, ве T2A сырасы вастасынен кадрда mCherry иле бирлештириле. Grx1-roGFP2 – бу Гейдельберг Т.П.Дик ДФКЗ (Дойче Кребсфоршунгцентр) ширкетининъ бахшышыдыр. tdTomato кассетасыны адеттеки клонирлеме усулларынен денъиштирмекнен, кассета pAAV-CAG-FLEX-tdTomato омуз агъына (Addgene 28306 истинадий номерасы) субклонланды ве pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFNGAV-VCA5, pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFGA2-VCA5 мейдангъа кетирильди. ФЛЕКС-мЧерри-Т2А-МФН1-В5 ве пААВ-САГ-ФЛЕКС-Гркс-роГФП2 векторлары. Бойле стратегия pAAV-CAG-FLEX-mCherry идаре векторыны мейдангъа кетирмек ичюн де къулланылды. ААВ-шПКх конструкциясыны мейдангъа кетирмек ичюн плазмид ААВ векторы (VectorBuilder, pAAV [шРНК] -CMV-mCherry-U6-mPcx- [шРНК#1]) керек, онынъ теркибинде шРНК нишанлы сычан ПКхны кодлагъан ДНК сырасы бар (5′GTAGCTAGCTTTCGCTGACTACTA 3′) U6 промоторынынъ незарети алтында mCherry CMV промоторынынъ незарети алтында къулланыла. Ярдымджы ААВ векторларыны чыкъарув истисалджынынъ (Cell Biolabs) косьтергичи боюнджа япылды. Къыскъадан айткъанда, мЧерри-Т2А-МФН2-В5 (рААВ-САГ-ФЛЕКС-мЧерри-Т2А-МФН2-В5), мЧерри-Т2А-МФН1-В5 (рААВ-САГ-ФЛЕКС-мЧерри) ташыгъан кочюрильме плазмиданы къулланынъыз, мЧерри-Т2А-МФН1-В5 (рААВ-САГ-ФЛЕКС-мЧерри) мЧ9МФАВ23 улькенинъ трансфекциясы). (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) я да Grx-roGFP2 (pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2) кодлайыджы ген, эм де AAV1 капсид акъикъыны ве ярдымджы акъикъны кодлайыджы Плазмид плазмидасыны къапламакъ, кальций фосфат усулынен. Хам вирус супернатанты къуру буз/этанол ваннасында бузлав-иритюв девирлери ярдымынен эльде этильди ве улькелер фосфат буферли физиологик еринде (ФБФ) лиз этильди. ААВ векторы узюльмез йодиксанол градиентли ультрацентрифуга ярдымынен (32 000 айланув/дакъкъада ве 4°С температурада 24 саат) темизленди ве Amicon ультра-15 центрифуга фильтри ярдымынен концентрацияланды. ААВ1-САГ-ФЛЕКС-мЧерри-Т2А-МФН2-В5 [2,9×1013 геном копиясы (ГС)/мл], ААВ1-САГ-ФЛЕКС-мЧерри (6,1×1012 реаль ГС/мл), ААВ1-САГ-ФЛЕКСнинъ геном титри эвелькиси киби микъдарлы шекильде (ПЦР5вакъыт) ольчеди. (кПЦР) -МФН1-В5 (1,9×1013 ГК/мл) ве ААВ1-САГ-ФЛЕКС-Гркс-роГФП2 (8,9×1012 ГК/мл) ола.
Биринджи нейронлар буз киби сувукъ 1х ПФС-те тыраш этильди, пеллетленди, сонъра 0,5% Triton X-100 / 0,5% натрий дезоксихолат/ПФС лизис буферинде, теркибинде фосфатаза ве протеаза ингибиторы (Roche) гомогенлештирильди. Акъсиллернинъ микъдарыны бицинхонин кислота анализи (Thermo Fisher Scientific) ярдымынен бельгиледилер. Сонъра акъсиллер SDS-полиакриламид гель электрофорези ярдымынен айырылды, сонъра исе поливинилиденфторид мембранасына (GE Healthcare) ляк къоюлды. Специфик олмагъан ерлерни къапатынъыз ве биринджи антителонен (тафсилятлы малюмат ичюн S1 джедвельге бакъынъыз) 5% сютте ТБСТ (Триннен Трис-буферли физиологик ер) ичинде, ювув адымларында ве экинджи антителонен ТБСТ Инкубацияда инкубация этинъиз. Биринджи антителонен +4°С температурада гедже инкубация этинъиз. Ювгъан сонъ, экинджи дереджели антителоны ода араретинде 2 саат девамында къоймакъ керек. Сонъра айны шу дамланы анти-β-актин антителосынен инкубация этип, айны юкленюв тасдыкъланды. Химилюминесценциягъа чевирильмек ве химилюминесценцияны къуветлештирмек ёлунен тапмакъ (GE Healthcare).
Эвельден джам къаплама листлерине экильген нейронлар ода араретинде белли бир вакъыт нокътасында 4% параформальдегид (ПФА)/ПФС иле 10 дакъкъа девамында бекленильди. Къаплама листлери башта ода араретинде 5 дакъкъа девамында 0,1% Triton X-100/PBS иле, сонъра исе блокирующий буферде [3% тувар къан плазма альбумини (BSA)/PBS] иле кечириле. Экинджи куню къаплама листлерни блокирующий буфернен ювдылар ве ода араретинде 2 саат девамында уйгъун флюорофорнен конъюгациялангъан экинджи дереджели антителонен инкубация эттилер; ниает, нумюнелерни 4′,6-диамидино-2 -Фенилиндол (DAPI) къаршы боялангъан ПФС-те яхшы этип ювдылар ве сонъра Aqua-Poly/Mount иле микроскоп слайдында пекиттилер.
Сычанларгъа (эркек ве къадын) кетамин (130 мг/кг) ве ксилазин (10 мг/кг) перитонеаль инъекция ярдымынен наркоз япылды ве тери астына карпрофен анальгетик (5 мг/кг) , Ве стереотактик алетке (Kopped a pamf) war equim. Къафасыны ачып, тиш бургъусынен мис кемигине келишкен мийчик къабугъынынъ къысмыны инджелемек керек (лямбдадан: къуйрукъ 1,8, ян 1, IV ве V лобуляларгъа келишкен). Эгильген шприц инесинен баш скелетинде мукъайтлыкънен кичик бир тешик япынъыз, ашагъыдаки къан дамарларыны бозмамакъ ичюн. Сонъра индже чекильген джам капиллярыны яваш-яваш микротешикке (дура матернинъ вентраль тарафында -1,3-тен -1-гедже) кирсетелер ве 200-ден 300 нл ААВ микроинжекторгъа (Наришиге) 200-ден 300 нл ААВ-ны эль шприцлеринен (Наришиге) 200 градускъадже алчакъ вакъыт девамында инъекция этелер. дакъкъа пенджереси. Инфузиядан сонъ, вирус бутюнлей даркъалсын деп, капиллярны даа 10 дакъкъагъа къоймакъ керек. Капиллярлар чыкъарылгъан сонъ, яра ялынъызлыгъыны эксильтмек ве айваннынъ сагъламлашмасы ичюн териге мукъайтлыкънен тикелер. Айванлар амелияттан сонъ бир къач кунь девамында агъры кесювджилернен (каспофен) тедавийлендилер, бу вакъыт девамында оларнынъ физики вазиети дикъкъатнен козетильди ве сонъра оларны косьтерильген вакъыт нокътасында эвтаназия эттилер. Бутюн процедуралар Авропа, миллий ве институциональ ёлбашчылыкъкъа коре кечирильди ве Алманиянынъ Шималий Рейн-Вестфалия, Умвелт ве Verbraucherschutz шеэрлериндеки LandesamtfürNatur тарафындан тасдикъланды.
Айванларгъа кетамин (100 мг/кг) ве ксилазин (10 мг/кг) наркоз япылды, юрекке башта 0,1 М ПФС, сонъра исе ПФС ичинде 4% ПФА перфузия этильди. Токъума дискретлештирильди ве 4°С температурада 4% ПФА/ПФС ичинде гедже девамында фиксацияланды. ПБС-те тургъан мийден сагитал кесиклерни (къалынлыгъы 50 мкм) азырламакъ ичюн титреген пычакъ (Leica Microsystems GmbH, Вена, Австрия) къулланылды. Башкъа шей косьтерильмеген олса, сербест ялдагъан кесиклерни боялав ода араретинде ве къарыштырувда юкъарыда (13) тасвирленгени киби япылды. Къыскъадан айткъанда, биринджиден, эльде этильген дилимлерни ода араретинде 15 дакъкъа девамында 0,5% Triton X-100/PBS иле пермеабилизация эттилер; базы эпитоплар ичюн (Pcx ве Shmt2) 80°С (РН 9) температурада трис-ЭДТА буферинде бу адым ерине 25 дакъкъа девамында дилимлерни къыздырынъыз. Сонъра кесиклерни биринджи антителонен (S1 джедвельге бакъ.) 4°С температурада гедже къарыштырувнен блокирующий буферде (3% БСА/ПФС) инкубация этелер. Эртеси куню кесиклерни блокировщик буфернен ювдылар ве ода араретинде 2 саат девамында уйгъун флюорофорнен конъюгациялангъан экинджи дереджели антителонен инкубация эттилер; ниает, кесиклерни ПФС-те яхшы этип ювдылар, ДАПИ иле къаршы бояладылар, сонъра AquaPolymount On a microscope slide иле пекиттилер.
Орнекни тасвир этмек ичюн беяз ярыкъ лазери ве 405 диодлы ультрафиолет лазеринен донатылгъан лазерли сканерлейиджи конфокаль микроскоп (TCS SP8-X я да TCS Digital Light Sheet, Leica Microsystems) къулланылды. Флюорофорны къозгъап, сигналны Hybrid Detector (HyDs) ярдымынен топлап, LAS-X программасы ярдымынен Найквистнинъ нумюне алувына келишкен джыйылгъан тасвирлерни сыралы режимде топладылар: микъдарсыз панельлер ичюн бу юксек динамик сигналлар (меселя, соматик улькелерде ве дендритлерде Hybridse in PDY numberte) mt ЯрыкъР режими). Фонны эксильтмек ичюн 0,3 — 6 нс къапу къулланыла.
Сыралангъан улькелернинъ керчек вакъытта тасвирленмеси. 1% В27 къошмасы ве 0,5 мМ GlutaMax олгъан Neurobasal-A муитинде сыралангъан сонъ, улькелерни деръал поли-l-лизиннен къаплангъан джам слайдларгъа эктилер (μ-Слайд8 Къую, Ibidi, каталог номерасы 80826) , Ве сонъра оны а°С температурада туттылар ве 350 температурагъадже а°С температурада туттылар. ерлешмек ичюн. Реаль вакъытта тасвирлев беяз лазер, HyD, 63×[1,4 ракъамлы диафрагмалы (NA)] ягълы объектив линзасы ве къыздырув басамакънен донатылгъан Leica SP8 лазерли сканерлейиджи конфокаль микроскопта япылды.
Сычангъа тез-тез углекислый газнен наркоз япып, башыны кестирдилер, мийни баш скелетинден тез-тез чыкъардылар ве 200 мкм къалынлыкъта (13С маркировка эксперименти ичюн) я да 275 мкм къалынлыкъта (эки фотон эксперименти ичюн) сагитал кесикке кесип, ашагъыдаки crece материалларынен толдурдылар (The VH-5r6). Scientific, Walldorf, Germany) бойле мадделернен толдурылгъан: 125 мМ буз киби сувукъ, углероднен тоюндырылгъан (95% O2 ве 5% CO2) алчакъ Ca2 + суний мий-омуз суву (ACSF) NaCl, 2,5 мМ KCl, 1,25 мМ натрий м52, Na32. глюкоза, 0,5 мМ CaCl2 ве 3,5 мМ MgCl2 (осмотик басым 310 — 330 ммоль) ола. Алынгъан мий дилимлерини инкубациядан эвельки камерагъа кечиринъиз, онынъ теркибинде зияде Са2 + АССФ (125,0 мМ NaCl, 2,5 мМ KCl, 1,25 мМ натрий фосфат буфери, 25,0 мМ NaHCO3, 25,0 мМ д-глюкоза, Ca2 мМ02 ве 125 мМ d-глюкоза). MgCl2) Орта) рН 7,4 ве 310 дан 320 ммольгедже).
Тасвирлев джерьянында дилимлерни айрыджа тасвирлев одасына авуштырдылар ве эксперимент 32°-33°С даимий араретте токътамайып АКСФ перфузиясы алтында япылды. Кесиклерни тасвир этмек ичюн Leica 25x объектив (NA 0,95, сув), Ti: Sapphire лазери (Chameleon Vision II, Coherent) иле донатылгъан чокъ фотонлы лазерли сканерлев микроскопы (TCS SP8 MP-OPO, Leica Microsystems) къулланылды. ФЛИМ модули (ПикоХарп300, ПикоКвант) ола.
Грх1-роГФП2 нинъ ФЛИМ. ПН-лернинъ цитоплазма редокс алындаки денъишмелер сагитал мий дилимлеринде эки фотонлы ФЛИМ ярдымынен ольченильди, анда Grx1-roGFP2 биосенсоры ПН-лерни нишан алды. ПН къатламында эльде этюв мейданчыгъы дилим юзюнден 50-80 мкм ашагъыда сечиле, бойлеликнен омюрге ляйыкъ ПН (яни дендритлер боюнджа монджукълы къурулышнынъ олмамасы я да нейрон морфологик денъишмелери) ве эки къатлы мусбет roGFP2 сенсоры ве AAVx контроль iRNA кодлайыджы shRNA ола. мЧерри). 2х ракъамлы зумнен бир стекли тасвирлерни топламакъ [къозгъалув далгъасынынъ узунлыгъы: 890 нм; 512 нм 512 пиксель ола]. Ачыкълав: ички HyD, флюоресцеин изотиоцианат (FITC) фильтр группасы] ве 2-3 дакъкъа ичинде тасвирнинъ орталамасы къулланыла, бу исе эгри уйдурма ичюн етерли фотон топлангъаныны (джеми 1000 фотон) темин эте. Grx1-roGFP2 зонднынъ сезиджилиги ве FLIM шараитлерининъ тешкерильмеси перфузиялы АССФ-ге экзоген 10 мМ Н2О2 къошулгъанда roGFP2нинъ омюр муддетининъ къыйметини козетюв ёлунен япылды (оксидленювни максималь шекильде арттырмакъ ичюн, бу исе омюрнинъ муддетини арттырувгъа кетире), сонъра исе mreminimizitzo of эксильмеси, бунынъ нетиджесинде омюрнинъ узунлыгъы эксиле) (С8 рес., Д ден Г гедже). Алынгъан нетиджелерни талиль этмек ичюн FLIMfit 5.1.1 программасыны къулланынъыз, бутюн тасвирнинъ бир экспоненциаль парчаланув эгрисини ольчев ИРФ-ке (алетнинъ джевап функциясы) келиштиринъиз, χ2 исе тахминен 1. микъдарны бельгилемек ичюн къулланыла.
Митохондриянынъ потенциалыны талиль этмек. Отькюр кесикни перфузиялангъан АКСФ-ке догърудан-догъру къошулгъан 100 нМ ТМРМ иле 30 дакъкъа девамында инкубация япкъан сонъ, ПН-лернинъ митохондрия потенциалынынъ денъишмелери эки фотонлы микроскоп ярдымынен ольченильди. ТМРМ тасвирлеви 920 нм-де зондны къозгъамакъ ве сигналларны топламакъ ичюн ички HyD (тетраметилродамин изотиоцианат: 585/40 нм) къулланмакъ ёлунен япылды; айны къозгъалыш далгъа узунлыгъыны къулланып, амма башкъа ички HyD (FITC :525/50) къулланып, mtYFP тасвирлемек мумкюн. Бир ульке севиесинде митохондриянынъ потенциалыны къыймет кесмек ичюн ImageJнинъ Image Calculator плагинини къулланынъыз. Къыскъадан айткъанда, уйгъун каналнынъ бир стекли конфокаль тасвиринде Пуркинже сомали тилинде ТМРМ сигналы косьтерильген митохондрия регионыны бельгилемек ичюн плагин мусавийлемеси: сигнал = мин (mtYFP, TMRM) къулланыла. Сонъра пейда олгъан маскадаки пиксель мейданлыгъы микъдарджа эсаплана, сонъра исе mtYFP каналынынъ уйгъун босагъа бир стеки тасвиринде нормаллештириле, бойлеликнен митохондрия потенциалыны косьтерген митохондрия фракциясы эльде этиле.
Образны «Гюйгенс Про» (Scientific Volume Imaging) программасы ярдымынен деконволюция эттилер. Плиткаларнынъ сканерленген ресимлери ичюн бир плитканынъ монтажы LAS-X программасы тарафындан берильген автоматик тикиш алгоритми ярдымынен япыла. Ресимни калибрлеген сонъ, ресимни даа да ишлемек ве ярыкълыкъ ве контрастны бир тюрлю ерлештирмек ичюн ImageJ ве Adobe Photoshop программаларыны къулланынъыз. Графика азырламакъ ичюн Adobe Illustrator программасыны къулланынъыз.
мтДНК фокус талили. ДНКгъа ​​къаршы антителоларнен бельгиленген мийчиклернинъ кесиклеринде мтДНК лезияларынынъ сайысы конфокаль микроскоп ярдымынен микъдарджа эсапланды. Эр бир макъсадлы мейданлыкъ улькенинъ джесети ве эр бир улькенинъ озеги ичюн яратылды, уйгъун мейданлыкъ исе Multi Measure плагини (ImageJ программасы) ярдымынен эсапланды. Цитоплазма мейданлыгъыны эльде этмек ичюн, ульке беденининъ мейданлыгъындан озек мейданлыгъыны чыкъарынъыз. Ниает, Analyze Particles плагини (ImageJ программасы) ярдымынен босагъа тасвиринде мтДНК косьтерген цитоплазма ДНК нокъталарыны автоматик шекильде микъдарджа эсапладылар ве эльде этильген нетиджелер CTRL сычанларнынъ PN орталамасына нормаллештирильди. Нетиджелер бир улькедеки нуклеозидлернинъ орта сайысы оларакъ ифаделенелер.
Акъсиллернинъ ифаделенювини талиль этмек. ПН-де бир ульке севиесинде акъсиллернинъ ифаделенювини къыймет кесмек ичюн ImageJ-нинъ Image Calculator плагинини къулланынъыз. Къыскъадан айткъанда, уйгъун каналнынъ бир къатлы конфокаль тасвиринде: сигнал = мин (mtYFP, антитело) мусавийлемеси вастасынен Пуркинада белли бир антителогъа иммунореактивлик косьтерген митохондрия регионы белли ола. Сонъра пейда олгъан маскадаки пиксель мейданлыгъы микъдарджа эсаплана, сонъра исе mtYFP каналынынъ уйгъун босагъа бир стекли тасвиринде нормаллештириле, бойлеликнен косьтерильген акъсилнинъ митохондрия фракциясы эльде этиле.
Пуркиндженинъ ульке сыкълыгъыны талиль этмек. ImageJ программасынынъ Cell Counter плагини ярдымынен Пуркиндженинъ сыкълыгъыны къыймет кесмек ичюн, сайылгъан Пуркиндже улькелерининъ сайысыны сайылгъан улькелернинъ ишгъаль эттиги мийчик алкъасынынъ узунлыгъына болип, къыймет кесмек мумкюн эди.
Орнек азырлав ве топлав. Незарет группасындан ве Mfn2cKO сычанларындан алынгъан мийлер 0,1 М фосфат буферинде (ПБ) 2% ПФА/2,5% глутаральдегидте фиксацияланды, сонъра исе цилиатлар (Leica Mikrosysteme GmbH, Вена, Австрияда) ярдымынен корональ кесиклер азырланды (Къалынлыгъы мкм1 oПБ0 ичинде фиксацияланды) тетраоксид ве 1,5% калий ферроцианидини ода араретинде 1 саат девамында къоймакъ керек. Кесиклерни учь кере дистиллированный сувнен ювдылар, сонъра 20 дакъкъа девамында 1% уранил ацетат олгъан 70%-ли этанолнен бояладылар. Сонъра кесиклерни градациялы спиртте сувсызландырдылар ве кремнийнен къаплангъан джам слайдлары арасында Durcupan ACM (Araldite casting resin M) эпоксид катранына (Electron Microscopy Sciences, каталог номерасы 14040) къойдылар ве ниает 60°С температурада фурунда48 Полимеризация эттилер. Мийчик къабугъынынъ мейданлыгъы сечильди ве Leica Ultracut (Leica Mikrosysteme GmbH, Вена, Австрия) махсулатында 50 нм ультраиндже кесиклер кесильди ве полистирол пленканен къаплангъан 2×1 мм бакъыр ярылгъан сетке джыйылды. Кесиклерни 10 дакъкъа девамында Н2О ичинде 4% уранил ацетатнынъ эритмесинен бояладылар, бир къач кере Н2О иле ювдылар, сонъра 10 дакъкъа девамында Н2О ичинде Рейнольдс къуршун цитраты иле, сонъра бир къач кере Н2О иле ювдылар. Микрографиялар Philips CM100 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) ёлланма электрон микроскопынен TVIPS (Tietz видео ве тасвир ишлев системасы) TemCam-F416 ракъамлы фотоаппараты (TVIPS GmbH, Gauting, АКъШ) ярдымынен япылды. Алмания).
ААВ-нен зарарлангъан сычанлар ичюн мий айырылып, 1 мм къалынлыкътаки сагитал кесикке кесильди, ААВ-нен зарарлангъан алкъаны (яни mCherry экспрессиясыны) бельгилемек ичюн флюоресцент микроскоп ярдымынен мийчикни тешкердилер. Тек ААВ инъекциясы энъ аздан эки арды-сыра кельген мийчик алкъаларында Пуркинже ульке къатламынынъ (яни деерлик бутюн къатламнынъ) пек юксек трансдукция эффективлигини мейдангъа кетирген теджрибелер къулланыла. ААВ-трансдукциялангъан илле гедже девамында фиксациядан сонъ микродиссекция япылды (0,1 М кокао буферинде 4% ПФА ве 2,5% глутаральдегид) ве илериде ишленди. ЭПОН къоймакъ ичюн тургъун токъума 0,1 М натрий какао буферинен (Applichem) ювулды, ве 2% OsO4 (os, Science Services; Caco) иле 0,1 М натрий какао буферинде (Applichem) 4 Саат инкубация этильди, сонъра 2 саат ювулды. 0,1 М кокамид буфери иле 3 кере текрарламакъ керек. Сонъра этанолнынъ котерилюв сырасы ярдымынен эр бир этанол иляджыны 4°С температурада 15 дакъкъа девамында инкубация этип, токъуманы сувсызландырдылар. Токъума пропилен оксидке кечирильди ве 4°С температурада ЭПОН (Сигма-Ольдрих) ичинде гедже инкубация этильди. Токъуманы ода араретинде 2 саат девамында тазе ЭПОНгъа къойып, сонъра 62°С температурада 72 саат девамында ерлештиринъиз. Ультрамикротом (Leica Microsystems, UC6) ве эльмаз пычагъы (Diatome, Biel, Switzerland) ярдымынен 70 нм ультраиндже кесиклерни кесинъиз, ве 37°С температурада 15 дакъкъа девамында 1,5% уранил ацетатнен бояла- нъыз, 4 дакъкъа девамында исе къуршун цитраты иляджынен бояла- нъыз. Электрон микрографиялары Camera OneView 4K 16-битли (Gatan) ве DigitalMicrograph программасы (Gatan) иле донатылгъан JEM-2100 Plus узатма электрон микроскопы (JEOL) ярдымынен япылды. Талиль ичюн 5000× я да 10 000× ракъамлы зумнен электрон микрографиялар эльде этильди.
Митохондрияларнынъ морфологик талили. Бутюн талиль ичюн айры митохондрияларнынъ контурлары ImageJ программасы ярдымынен ракъамлы тасвирлерде эльнен сызылды. Чешит морфологик параметрлер талиль этиле. Митохондрия сыкълыгъы эр бир улькенинъ умумий митохондрия мейданлыгъыны цитоплазма мейданлыгъына болип эльде этильген фаиз оларакъ ифаделене (цитоплазма мейданлыгъы = ульке мейданлыгъы-ульке озеги мейданлыгъы) × 100. Митохондрияларнынъ тёгереклиги [4π∙2(мейданлыкъ)]/периметр формуласынен эсаплана. Митохондрияларнынъ ист морфологиясы талиль этильди ве оларнынъ эсас шекиллерине коре эки категориягъа («боручыкъ» ве «пузырь») болюнди.
Автофагосома/лизосоманынъ сайысы ве сыкълыгъынынъ талили. ImageJ программасы ярдымынен ракъамлы тасвирдеки эр бир аутофагосома/лизосоманынъ контурларыны эльнен сызынъыз. Автофагосома/лизосома мейданлыгъы эр бир улькенинъ умумий автофагосома/лизосома къурулыш мейданлыгъыны цитоплазма мейданлыгъына болип эсаплангъан фаиз шеклинде ифаделене (цитоплазма мейданлыгъы=ульке мейданлыгъы-озек мейданлыгъы)×100. Аутофагосомаларнынъ/лизосомаларнынъ сыкълыгъы умумий сайыны бир улькедеки аутофагосома/лизосома къурулышларынынъ сайысына болип эсаплана (цитоплазма мейданлыгъы джеэтинден) (цитоплазма мейданлыгъы = ульке мейданлыгъы-озек мейданлыгъы).
Отькюр кесюв ве нумюне азырлав ичюн маркировка. Глюкоза маркировкасыны талап этмек ичюн теджрибелер ичюн кескин мий дилимлерини инкубациядан эвельки камерагъа авуштырынъыз, онынъ теркибинде тоюндырылгъан углерод (95% O2 ве 5% CO2), юксек Ca2 + ACSF (125,0 мМ NaCl, 2,5 мМ KCl, 1,25 мМ натрий мНС2O, 1,25 мМ натрий фосфаты) бар. 25,0 мМ д-глюкоза, 1,0 мМ CaCl 2 ве 2,0 мМ MgCl 2, рН 7,4 ве 310 дан 320 мОсмгъадже ерлештирильген), онда глюкоза 13 С 6- Глюкоза ерине къоюлгъан (Eurisotop, каталог номерасы CLM9-1). Пируват маркировкасыны талап этмек ичюн теджрибелер ичюн кескин мий дилимлерини даа юксек Са2 + АССФ-ге (125,0 мМ NaCl, 2,5 мМ KCl, 1,25 мМ натрий фосфат буфери, 25,0 мМ NaHCO3, 25,0 мМ Ad2C м-глюкоза, 100 мМ d-глюкоза ве 100 мМ) кечирмек керек. MgCl2, рН 7,4 ве 310 дан 320мОсмгъадже ерлештирмек керек), ве 1 мМ 1-[1-13С]пируват (Eurisotop, каталог номерасы CLM-1082) къошмакъ керек. Кесиклерни 37°С температурада 90 дакъкъа девамында инкубация этинъиз. Денъевнинъ сонъунда кесиклерни 75 мМ аммиак карбонаты олгъан сувлу иляджнен (рН 7,4) тез ювдылар, сонъра 40:40:20 (об:об:об) атсетонитрильде (АСН): метанол: сувда гомогенлештирдилер. Кесиклер буз устюнде 30 дакъкъа инкубация этильген сонъ, нумюнелер 21 000 г температурада 4°С температурада 10 дакъкъа девамында центрифугагъа къоюлды, темиз супернатантны исе SpeedVac концентраторында къуруттылар. Алынгъан къуругъан метаболит пеллетини анализ япылгъандже -80°С температурада сакълай эдилер.
С-белгиленген 13 аминокислотанынъ сувлу хроматография-масса спектрометриясы талили. Сувлы хроматография-масса спектрометриясы (СХ-МС) анализи ичюн метаболит пеллетини 75 мкл СХ-МС сыныфлы сувда (Honeywell) гъайрыдан суспензия эттилер. 000 г температурада 4°С температурада 5 дакъкъа девамында центрифугалангъан сонъ, 20 мкл айдынлатылгъан супернатанты аминокислота акъымы анализи ичюн къулланылды, къалгъан экстракт исе деръал анион анализи ичюн къулланылды (ашагъыгъа бакъ). Аминокислота анализи эвельден тасвирленген бензоилхлорид дериватизация протоколы ярдымынен япылды (55, 56). Биринджи адымда 20 мкл метаболит экстрактына 10 мкл 100 мМ натрий карбонаты (Сигма-Ольдрих) къошулды, сонъра исе 10 мкл 2% бензоилхлорид (Сигма-Ольдрих) LC сыныфлы АСН-ге къошулды. Орнекни къыскъадан бурюштирдилер ве сонъра 21 000 г температурада 20°С температурада 5 дакъкъа девамында центрифугагъа къойдылар. Темизленген супернатантны 2 мл автопробирка флаконына конус шекилли джам къошмасы (200 мкл колем) иле кечиринъиз. Нумюнелер Q-Exactive (QE)-HF (Ultra High Field Orbitrap) юксек ифадели догърулыкълы масса спектрометрине (Thermo Fisher Scientific) багълангъан Acquity iClass ультра юксек перформанслы ЖК системасы (Waters) ярдымынен талиль этильди. Талиль ичюн деривативлештирильген нумюненинъ 2 мкл 100×1,0 мм юксек къаттылыкълы кремний Т3 колонкасына (Waters) инъекция этильди, онынъ ичинде 1,8 мкм парчачыкълар бар эди. Акъынты 100 мкл/дакъкъа, буфер системасы исе А буферинден (10 мМ аммиак формальдеги ве сувда 0,15% мурджие кислотасы) ве В буферинден (АСН) ибарет. Градиент бойле ола: 0 дакъкъада 0%В; 0%Б. 0 дан 15% В 0 дан 0,1 дакъкъагъадже; 15 — 17% В 0,1 — 0,5 дакъкъада; В 17 — 55% 0,5 — 14 дакъкъада; В 14 — 14,5 дакъкъада 55 — 70%; 14,5 ден 70 ден 100% В температурада 18 дакъкъада; 100% В 18 — 19 дакъкъада; 100 - 0% В 19 - 19,1 дакъкъада; 0% В 19,1 - 28 дакъкъада (55, 56). QE-HF масса спектрометри мусбет ионизация режиминде м/з (масса/заряд нисбети) масса диапазоны 50-ден 750-ге къадар олгъанда чалышмакъта.Къулланылгъан чешитлик 60 000, эльде этильген къазанч идареси (АГК) ион нишанеси исе 3×106, ионнынъ энъ буюк вакъты исе1000100 млн. Къыздырылгъан электропульверизатор ионизациясы (ЭПИ) менбасы 3,5 кВ пульверизатор кергинлигинде, 250°С капилляр араретинде, 60 АЕ (ихтиярий бирлемлер) тышкъы ава акъымы ве 20 АЕ ярдымджы ава акъымы иле чалышалар. 250°С температурада ола. S линзасы 60 АЕ ольчюсине къоюлгъан.
13С бельгиленген органик экшиликлернинъ анион хроматографиясы-МС анализи. Къалгъан метаболит чёкюндиси (55 мкл) QE-HF масса спектрометрине (Thermo Fisher Scientific) багълангъан Dionex ион хроматография системасы (ICS 5000+, Thermo Fisher Scientific) ярдымынен талиль этильди. Къыскъадан айткъанда, 5 мкл метаболит экстракты ВЭЖХ (2 мм×250 мм, парчачыкъларнынъ колеми 4 мкм, Thermo Fisher Scientific) иле донатылгъан Dionex IonPac AS11-HC колонкасына 1. )он толдурув нисбети иле итекли къысмий илле режиминде инъекция этильди. Дионекс ИонПак АГ11-НС къорчалайыджы колонкасы (2 мм х 50 мм, 4мкм, Термо Фишер Сайентифик). Колоннанынъ арарети 30°С ола, автопробирка исе 6°С ола. Элюент генераторы вастасынен калий гидроксиди градиентини мейдангъа кетирмек ичюн деионлаштырылгъан сувнен теминленген калий гидроксиди картриджини къулланынъыз. Метаболитлерни 380 мкл/дакъкъа акъынты тезлигинен айырмакъ, бойле градиентни къулланмакъ: 0 — 3 дакъкъа, 10 мМ КОН; 3 — 12 дакъкъа, 10 — 50 мМ КОН; 12 — 19 дакъкъа, 50 — 100 мМ КОН; 19 — 21 дакъкъа , 100 мМ КОН; 21 — 21,5 дакъкъа, 100 — 10 мМ КОН. Колонканы 10 мМ КОН алтында 8,5 дакъкъа девамында янъыдан мувазенеге кетирдилер.
Элюирленген метаболитлер колонкадан сонъ 150 мкл/дакъкъа изопропанол къошма акъымы иле бирлештириле ве сонъра менфий ионизация режиминде чалышкъан юксек ифадели масса спектрометрине ёллана. МС 60 000 чешитликнен м/з 50-ден 750-гедже олгъан кутьле диапазоныны козете. АГК 1×106 ольчюсинде къоюла, энъ чокъ ион вакъты исе 100 мс ола. Къыздырылгъан ЭСИ менбасы 3,5 кВ ягъмур кергинлигинде чалышкъан. Ион менбасынынъ дигер параметрлери бойледир: капилляр арарети 275°С; къыны газ акъымы, 60 АЕ; ярдымджы газ акъымы, 300°С температурада 20 АЕ ве S линзанынъ 60 АЕ ерине къоюлмасы.
13С бельгиленген метаболитлернинъ малюматларыны талиль этмек. Изотоплар нисбетининъ малюматларыны талиль этмек ичюн TraceFinder программасыны (4.2 версиясы, Thermo Fisher Scientific) къулланынъыз. Эр бир бирикменинъ айнылыгъы ишанчлы истинадий бирикме иле тасдыкъланды ве мустакъиль талиль этильди. Изотопларны зенгинлештирюв талилини япмакъ ичюн эр бир 13С изотопнынъ (Mn) экстракциялангъан ион хроматограммасынынъ (XIC) мейданлыгъы [M + H] + дан чыкъарылды, мында n — макъсадлы бирикменинъ карбон ракъамы, аминокислоталарны талиль этмек ичюн къулланыла я да [ MH] + анионларны талиль этмек ичюн къулланыла. ХИКнинъ кутьлевий догърулыгъы миллионда беш къысымдан эксик, РТнинъ догърулыгъы исе 0,05 дакъкъа. Зенгинлештирюв талили эр бир тапылгъан изотопнынъ уйгъун бирикменинъ бутюн изотопларынынъ джемисине нисбетини эсаплап япыла. Бу нисбетлер эр бир изотоп ичюн фаиз къыйметлери оларакъ бериле, нетиджелер исе, эвельден (42) тасвирленгени киби, моляр фаиз зенгинлештирюв (МФЗ) шеклинде ифаделене.
Бузулгъан нейрон пеллетини буз киби сувукъ 80%-ли метанолда (об/об) гомогенлештирдилер, бурюшиклер яптылар ве -20°С температурада 30 дакъкъа девамында инкубация эттилер. Орнекни кене де айландырып, +4°С температурада 30 дакъкъа къарыштырынъыз. Проба 21 000 г температурада 4°С температурада 5 дакъкъа девамында центрифугагъа къоюлды, сонъра алынгъан супернатанты топланды ве 25°С температурада SpeedVac концентраторы ярдымынен сонъраки анализ ичюн къурутылды. Юкъарыда къайд этильгени киби, сыралангъан улькелернинъ аминокислоталары узеринде ЖК-МС анализи япылды. TraceFinder (4.2 версиясы, Thermo Fisher Scientific) программасы ярдымынен эр бир бирикменинъ моноизотоп массасыны къулланып, малюматларнынъ талили япылды. Метаболитлернинъ малюматларыны квантиль нормаллештирюв preprocessCore программа пакетининъ ярдымынен япылды (57).
Дилимлерни азырлав. Сычанны тез вакъыт ичинде углекислый газнен наркоз япып, башыны кестирдилер, мийини баш скелетинден тез чыкъардылар, бузнен толдурылгъан титреген пычакъ (HM-650 V, Thermo Fisher Scientific, Walldorf, Germany) ярдымынен оны 300-ден 375 мк% углекислый газлы кесиклерге ( Colgittal gas2 O2 sa50) кестилер. СО2) Алчакъ Са2 + АССФ (125,0 мМ NaCl, 2,5 мМ KCl, 1,25 мМ натрий фосфат буфери, 25,0 мМ NaHCO3, 25,0 мМ d-глюкоза, 1,0 мМ CaCl2 ве 6,0 мМ just да Ad4012 ве 6,0 мМ just да Ad4030. мОсм). Алынгъан мий дилимлерини зияде Са2 + АССФ олгъан камерагъа (125,0 мМ NaCl, 2,5 мМ KCl, 1,25 мМ натрий фосфат буфери, 25,0 мМ NaHCO3, 25,0 мМ d-глюкоза, 4,0 мМ мМ Ca3C ве 4,0 мМ Ca3l5C) авуштырынъыз. ве 310 — 320 мОсм). Дилимлерни 20-30 дакъкъа сакъламакъ керек, бойледже, оларны язмаздан эвель тиклемек мумкюн.
язып алув. Бутюн язувлар ичюн тургъун язув камерасы ве 20 кере сувгъа батырылгъан объектив линзасынен (Scientifica) донатылгъан микроскоп санасы къулланылды. Пуркиньенинъ тахминли улькелери (i) беденнинъ колеми, (ii) мийчикнинъ анатомик ерлешмеси ве (iii) флюоресцент mtYFP хаберджи генининъ ифаделенмеси боюнджа белли этильди. Учь къаршылыгъы 5 — 11 мегом олгъан патч-пипетканы боросиликат джам капилляр (GB150-10, 0,86 мм×1,5 мм×100 мм, Science Products, Хофхайм, Алмания) ве горизонталь пипетка Instruments (P-1000), Sufhaim, No. Бутюн язувлар ELC-03XS npi патч-кламп къуветлештирджиси (npi electronic GmbH, Tam, Алмания) ярдымынен япылды, оны Signal программасы (6.0 версиясы, Cambridge Electronic, Кембридж, Буюк Британия) идаре эте эди. Денъев 12,5 кГц дискретлештирюв тезлигинде язылды. Сигнал 1,3 ве 10 кГц кесюв частоталары олгъан эки къыскъа кечиримли Бессель фильтринен сюзюле. Мембрана ве пипетканынъ емкости къуветлештирджи ярдымынен компенсация схемасы иле компенсациялана. Бутюн теджрибелер Orca-Flash 4.0 камерасынынъ (Hamamatsu, Герден, Алмания) идареси алтында япылды, оны Hokawo программасы (2.8 версиясы, Hamamatsu, Герден, Алмания) идаре эте эди.
Рутин бутюн улькенинъ конфигурациясы ве талили. Языдан эвель бирден пипеткагъа ашагъыдаки мадделер олгъан ички иляджны толдурынъыз: 4,0 мМ КСl, 2,0 мМ NaCl, 0,2 мМ ЭГТА, 135,0 мМ калий глюконаты, 10,0 мМ Гепес, 4,0 мМ АТФ.ТФотесин (ММ5г) (Na) ве 10,0 мМ креатинин фосфаты рН 7,25-ке къадар ерлештирильди, осмотик басым исе 290 мОсм (сахароза) олды. рА кучьни зарны ярмакъ ичюн къуллангъан сонъ, деръал раатлангъан зарнынъ потенциалы ольченильди. Кириш къаршылыгъыны -40, -30, -20 ве -10 рА гиперполяризациялы токлар къойып ольчейлер. Кергинликнинъ джевабынынъ буюклигини ольче ве кириш къаршылыгъыны эсапламакъ ичюн Ом къануныны къуллан. Спонтан фаалиет 5 дакъкъа девамында кергинлик кълыпында язылды, sPSC исе яры автоматик танымакъ скрипти ярдымынен Igor Pro (версия 32 7.01, WaveMetrics, Lake Oswego, Oregon, USA) программасында белли этильди ве ольченильди. IV эгриси ве стационар ток батареяны чешит потенциалларда (-110 мВ-дан башлап) къысып, кергинликни 5 мВ адымнен арттырув ёлунен ольчениле. АП чыкъарув деполяризация токуны къулланып сынавдан кечирильди. Деполяризация ток импульсини бергенде, -70 мВ температурада улькени къысынъыз. Эр бир язув блогынынъ адым колемини айрыджа (10 — 60 рА) ерлештиринъиз. Энъ юксек АП сыкълыгъына себеп олгъан импульс тырнакъларыны эльнен эсаплап, энъ буюк АП сыкълыгъыны эсапла. АП босагъасы биринджи кере бир я да бир къач АП-ни къозгъагъан деполяризация импульсининъ экинджи алынмасы ярдымынен талиль этиле.
Дешикли патчнынъ конфигурациясы ве талили. Стандарт протоколлар ярдымынен тешикли патч язувыны япынъыз. АТФ ве ГТФсиз пипетканы къулланынъыз, онынъ теркибинде ашагъыдаки мадделер олмасын: 128 мМ глюконат К, 10 мМ КСl, 10 мМ Гепес, 0,1 мМ ЭГТА ве 2 мМ MgCl2 ве рН 7,2-ге къадар ерлештиринъиз (КОН къулланып). Уджейре зарынынъ идаре этильмеген кечиримлилигининъ огюне кечмек ичюн, ич джесет иляджындан АТФ ве ГТФ чыкъарылыр. Пластер пипеткасына амфотерицин олгъан ички илядж (тахминен 200-ден 250 мкг/мл; G4888, Sigma-Aldrich) толдурыла, бойлеликнен тешильген пластырьнинъ язмасыны алалар. Амфотерицин диметилсульфоксидте (сонъки концентрациясы: 0,1 ден 0,3% гедже; ДМСО; D8418, Sigma-Aldrich) иритильди. Къулланылгъан ДМСОнынъ концентрациясы огренильген нейронларгъа ич бир тюрлю эмиетли тесир этмеди. Перфорация джерьянында каналнынъ къаршылыгъы (Ra) токътамайып козетильди, Ra ве АП амплитудасы стабиллешкен сонъ (20-40 дакъкъа) теджрибе башланды. Спонтан фаалиетни 2 — 5 дакъкъа девамында кергинлик ве/я да ток кълыпында ольчейлер. Малюматларнынъ талили Igor Pro (7.05.2 версиясы, WaveMetrics, АКъШ), Excel (2010 версиясы, Microsoft корпорациясы, Редмонд, АКъШ) ве GraphPad Prism (8.1.2 версиясы, GraphPad Software Inc., Ла-Холла, Калифорния штаты) программалары ярдымынен япылды. АКъШ). Спонтан АП-лерни бельгилемек ичюн IgorPro-нынъ NeuroMatic v3.0c плагини къулланыла. Эр бир язув ичюн индивидуаль шекильде уйгъунлаштырылгъан берильген босагъадан файдаланып, АП-лерни автоматик суретте бельгиленъиз. Спайк аралыгъыны къулланып, энъ буюк анлы шпайк сыкълыгъы ве орта шпайк сыкълыгъы олгъан шпайк сыкълыгъыны бельгиленъиз.
ПН изоляциясы. Эвель дердж этильген протоколгъа уйгъунлашып, ПН-лер сычаннынъ мийинден белли бир басамакъта темизленди (58). Къыскъадан айткъанда, мийчикни буз киби сувукъ диссоциация муитинде [HBSS Ca2+ ве Mg2+ олмадан, 20 мМ глюкоза, пенициллин (50 Е/мл) ве стрептомицин (0,05 мг/мл) къошып] дискретлештирдилер ве къырдылар, сонъра муитни мгССС1, папапал1 иле къошып азырладылар. / мл), папаин (16 Е / мл) ве дезоксирибонуклеаза I (ДНКаза I; 0,1 мг/мл)] 30°С температурада 30 дакъкъа девамында ишлетиле. Башта токъумаларны ферментли аш азырлавнынъ огюне кечмек ичюн ода араретинде йымырта балчыкъы (10 мг/мл), БСА (10 мг/мл) ве ДНКаза (0,1 мг/мл) олгъан ГБСС муитинде ювмакъ керек, сонъра исе 20 мМ глюкоза олгъан ГБСС муитинде Яваштан пенфлин/стремильм0СС ичинде уваламакъ керек. (0,05 мг/мл) ве ДНКаза (0,1 мг/мл) тек улькелерни чыкъаралар. Алынгъан ульке суспензиясы 70 мкм ульке сюзгючинден кечирильди, сонъра улькелер центрифуга ярдымынен пеллетленди (1110 айланув/дакъкъа, 5 дакъкъа, 4°С) ве сортламакъ муитинде [HBSS, 20 мМ глюкоза, 20% дёгме сыгъыр стремилин ве 20 мМ глюкоза, 20% дёгме сыгъыр стремилин иле къошулгъан) Сийдик къан плазма, (0,05 мг/мл)]; пропидий йодиднен улькенинъ яшайыш къабилиетини къыймет кесмек ве улькенинъ сыкълыгъыны 1×106 ден 2×106 ульке/мл-ге къадар ерлештирмек. Акъынты цитометриясындан эвель суспензияны 50 мкм ольчюдеки ульке сюзгючинден сюздилер.
Акъынты цитометри. Уджейрелерни сыралав 4°С температурада FACSAria III машинасы (BD Biosciences) ве FACSDiva программасы (BD Biosciences, 8.0.1 версиясы) ярдымынен япылды. Уджейре суспензиясы 100 мкм форсунка ярдымынен 20 функция басымда ~2800 вакъиа/с сурьатнен сыраланды. Адеттеки къапу критерийлери (уджейренинъ колеми, бимодаль айырув ве даркъалув хусусиетлери) ПН-нинъ башкъа ульке чешитлеринден догъру айырылмасыны темин этип оламагъаны ичюн, къапу стратегиясы митоЙФП+ ве идаре митоЙФП −де YFP ​​интенсивлиги ве автофлюоресценциясынынъ догърудан-догъру тенъештирювине эсасланып бельгилене. ЙФП нумюнени 488 нм лазер сызыгъынен нурландырув ёлунен къозгъала, сигнал исе 530/30 нм диапазонлы фильтр ярдымынен тапыла. MitoYFP+ ​​сычанларында нейрон бедени ве аксон парчаларыны айырмакъ ичюн Rosa26-mitoYFP хаберджи генининъ нисбий къувети де къулланыла. 7-ААД 561 нм сары лазернен къозгъала ве олю улькелерни чыкъармакъ ичюн 675/20 нм диапазонлы фильтрнен тапыла. Астроцитлерни айны вакъытта айырмакъ ичюн ульке суспензиясы АССА-2-АПК иле бояланды, сонъра нумюне 640 нм лазер сызыгъынен нурландырылды, сигналны тапмакъ ичюн 660/20 нм диапазонлы фильтр къулланылды.
Топлангъан улькелерни центрифуга ярдымынен пеллетледилер (1110 айланув/дакъкъа, 5 дакъкъа, 4°С) ве къулланылгъандже -80°С температурада сакъладылар. Mfn2cKO сычанлары ве оларнынъ литр балачыкълары процедура денъишмелерини энъ эксик дереджеге еткизмек ичюн бир куньде тасниф этиле. FACS малюматларыны такъдим этмек ве талиль этмек FlowJo программасы (FlowJo LLC, Ashland, Oregon, USA) ярдымынен япылды.
Юкъарыда къайд этильгени киби (59), сонъра мтДНК-ны микъдарджа бельгилемек ичюн сыралангъан нейронлардан ДНК айырмакъ ичюн акъикъий вакъыттаки ПЦР къулланыла. Сызыкълылыкъ ве босагъа сезиджилиги ильк оларакъ чешит сайыдаки улькелерде кПЦР чалыштырув ёлунен сынавдан кечирильди. Къыскъадан айткъанда, 50 мМ трис-НСl (рН 8,5), 1 мМ ЭДТА, 0,5% Твин 20 ве протеиназа К (200 нг/мл) ибарет олгъан лизис буферинде 300 ПН топлап, 55°С температурада 120 дакъкъа инкубация этинъиз. Сонъра 95°С температурада 10 дакъкъа девамында улькелерни инкубация эттилер, бойлеликнен протеиназа Книнъ бутюнлей инактивациясы темин этильди.mt-Nd1-ге хас олгъан TaqMan зонд (Thermo Fisher) ярдымынен мтДНК 7900HT Ficientimosher PCR системасында (Therificmosher) ярым микъдарлы ПЦР ёлунен ольченильди. Илим, каталог номерасы Mm04225274_s1), mt-Nd6 (Термо Фишер Сайентифик, каталог номерасы AIVI3E8) ве 18S (Термо Фишер Сайентифик, каталог номерасы Hs99999901_s1) генлери.
Протеом нумюнеси азырланув. дакъкъа девамында 95°С температурада эритмени къыздырмакъ ве ультрасес ярдымынен лизис буферинде [6 М гуанидин хлорид, 10 мМ трис(2-карбоксиэтил) фосфин гидрохлорид, 10 мМ хлорацетамид ве 100 мМ трис- НС пеллет бузлатылгъан нейронда]. дакъкъа девамында Биорупторда (Диагенод) (30 саниеде импульс / 30 саниеде пауза деври). Нумюне 20 мМ трис-НСl (рН 8,0) ичинде 1:10 ольчюде иритильди, 300 нг трипсин алтыны (Promega) иле къарыштырылды ве 37°С температурада гедже инкубация этильди, бойлеликнен, бутюнлей азырланувгъа иришильди. Экинджи куню нумюнени 20 000 г температурада 20 дакъкъа девамында центрифугагъа къойдылар. Супернатантны 0,1%-ли мурджие кислотасынен ириттилер, эритмени исе озь-озюни япкъан StageTips махсулатларынен тузсызландырдылар. Проба SpeedVac алетинде (Эппендорф концентраторы плюс 5305) 45°С температурада къурутылды, сонъра пептид 0,1%-ли мурджие кислотасында суспензияланды. Бутюн нумюнелерни бир вакъытта бир адам азырлады. Астроцит нумюнелерини талиль этмек ичюн 4 мкг тузсызландырылгъан пептидлер тандем масса биркасынен (TMT10plex, каталог номерасы 90110, Thermo Fisher Scientific) пептиднинъ ТМТ реактивине нисбети 1:20 олгъан ярлыкъларнен бельгиленди. ТМТ маркировкасы ичюн 0,8 мг ТМТ реактиви 70 мкл сувсыз АСН-де гъайрыдан суспензияланды, къуругъан пептид 9 мкл 0,1 М ТЭАБ (триэтиламмоний бикарбонаты) ичине гъайрыдан ерлештирильди, онъа 7 мкл АСН-де ТМТ реактиви къошулды. Концентрациясы 43,75% тешкиль этти. дакъкъа инкубациядан сонъ реакцияны 2 мкл 5%-ли гидроксиламиннен сёндюрдилер. Маркировкалангъан пептидлер топланды, къурутылды, 200 мкл 0,1%-ли мурджие кислотасында (ФЭ) гъайрыдан суспензияланды, экиге болюнди, сонъра озь-озюни япкъан StageTips ярдымынен тузсызландырылды. UltiMate 3000 ультра юксек перформанслы сувлу хроматограф (UltiMate 3000 ультра юксек перформанслы сувлу хроматограф) къулланып, эки ярыдан бириси 130Å1,7 мкм С18 парчачыкъларынен толдурылгъан 1 мм х 150 мм Acquity хроматографик колонкасында фракционлаштырылды (NoWaters:SKU609, catalog15). Термо Фишер ильмий ширкети). мкл/дакъкъа акъынты тезлигинен пептидлерни айырып, 1%-ден 50%-кедже В буферини 96 дакъкъа адымлы градиентнен 85 дакъкъа, 50%-ден 95%-кедже В буферини 3 дакъкъа, сонъра 95 % В буферини 8 дакъкъа айырынъыз; А буфери 5% АСН ве 10 мМ аммиак бикарбонаты (АВС), В буфери исе 80% АСН ве 10 мМ АВС ола. Эр 3 дакъкъада фракцияларны топлап, эки группагъа (1 + 17, 2 + 18 ве иляхре) бирлештиринъиз ве вакуум центрифугада къурутынъыз.
ЖК-МС/МС талили япмакъ. Кутьле спектрометриясы ичюн пептидлер (r119.aq ракъамы) 25 см, 75 мкм ички диаметрли UcoFrit аналитик колонкасында (янъы объектив линзасы, деталь ракъамы PF7508250) айырылды, о, 1,9 мкм ReproSil-Pur mat1se, C80. EASY-nLC 1200 («Термо Фишер Сайентифик», Алмания) ширкети. Колонна 50°С температурада тутулды. А ве В буферлери сувда 0,1% мурдар экшилиги ве 80% АСН-де 0,1% мурдар экшилигидир. Пептидлерни 200 нл/дакъкъа адымлы градиентнен 65 дакъкъа девамында 6%-ден 31%-кедже В буферинден, 31%-ден 50%-кедже В буферинден исе 5 дакъкъа девамында айырдылар. Элюирленген пептидлерни «Орбитрап Фьюжн» масса спектрометринде (Thermo Fisher Scientific) талиль эттилер. Пептид прекурсорынынъ м/з ольчюси 350-ден 1500 м/з диапазонында 120 000 чешитликнен япыла. 27% нормаллештирильген чарпышма энергиясыны къулланып, юксек энергиялы С тузакъ диссоциациясы (СТД) парчаланмасы ичюн 2-ден 6-гъадже зарядлы энъ кучьлю прекурсор сечиле. Девир вакъты 1 с ола. Пептид фрагментининъ м/з къыймети ион тузагъында энъ кичик АГК нишанеси 5×104 ве энъ буюк инъекция вакъты 86 мс къулланып ольченильди. Парчалангъан сонъ, прекурсорны 45 с девамында динамик чыкъарув джедвелине къойдылар. ТМТ-нен бельгиленген пептидлер 50 см, 75 мкм узунлыгъындаки Acclaim PepMap колонкасында (Thermo Fisher Scientific, каталог номерасы 164942) айырылды, миграция спектрлери исе Orbitrap Lumos Tribrid масса спектрометринде (Thermo Fisher Scientific high waymmetric withve) оларакъ талиль этильди. (FAIMS) донатмасы (Thermo Fisher Scientific) −50 ве −70 В эки компенсация кергинлигинде чалышалар.Синхронизация прекурсоры эсасында сечильген МС3 ТМТ рапорт ион сигналы ольчеви ичюн къулланыла. Пептидлернинъ айырылмасыны EASY-nLC 1200 устюнде, 90% сызыкълы градиент элюциясы къулланып, буфернинъ концентрациясы 6% -ден 31% -ге къадар яптылар; А буферинде 0,1% ФА, В буферинде исе 0,1% ФА ве 80% АСН бар эди. Аналитик колонка 50°С температурада чалышалар. Асыл файлны FAIMS компенсация кергинлигине коре больмек ичюн FreeStyle (1.6 версиясы, Thermo Fisher Scientific) программасыны къулланынъыз.
Акъсиллерни айырды этмек ве оларнынъ микъдарыны бельгилемек. Интеграль «Андромеда» къыдырув системасы ярдымынен ильк малюматлар MaxQuant 1.5.2.8 версиясы (https://maxquant.org/) ярдымынен талиль этильди. Aequorea victoria махлюкъындан эльде этильген Cre рекомбиназа ве YFP ​​сыраларындан гъайры, сычан истинадий протеомасынынъ канон сырасы ве изоформ сырасы (Proteome ID UP000000589, UniProt1020 майыс айында юкленильген) пептид фрагментининъ спектрлери къыдырылды. Метиониннинъ оксидленмеси ве акъсиллернинъ N-усть атсетилляциясы денъишкен модификациялар оларакъ къоюлды; цистеин карбамоил метилленмеси тургъун модификациялар оларакъ къоюлды. Азм параметрлери «спецификлик» ве «трипсин/Р» оларакъ къоюла. Акъсиллерни айырды этмек ичюн къулланылгъан пептидлернинъ ве бритва пептидлерининъ энъ аз сайысы 1; уникаль пептидлернинъ энъ аз сайысы 0. Пептидлернинъ харитасыны келиштирюв шараитлеринде акъсиллернинъ айдынлатув тезлиги 0,01 эди. «Экинджи пептид» варианты чалышмакъта. Чешит асыл файллар арасында мувафакъиетли айдынлатувларны кочюрмек ичюн «чалышувлар арасында келишюв» вариантыны къулланынъыз. Ярлыкъсыз микъдарлаштырув (ЯМ) ичюн ЛФК минималь нисбети 1 сайысыны къулланынъыз (60). ЛФК интенсивлиги эр бир вакъыт нокътасында энъ аздан бир генотип группасында энъ аздан эки догъру къыймет ичюн сюзюле ве 1000 кенъликтеки нормаль пайлашувдан экстраполяция этиле. 0,3 ве ашагъы 1,8 кет. ЛФК нетиджелерини талиль этмек ичюн Персей эсаплав платформасыны (https://maxquant.net/perseus/) ве R (https://r-project.org/) къулланынъыз. Дифференциаль ифаденинъ талили ичюн limma программа пакетинден эки тарафлы орта t тести къулланылды (61). Араштырма малюматларынынъ талили ggplot, FactoMineR, factoextra, GGally ве pheatmap къулланып япыла. ТМТ эсасында протеомика малюматлары MaxQuant 1.6.10.43 версиясы ярдымынен талиль этильди. 2018 сенеси сентябрь айында юкленильген UniProt компаниясынынъ инсан протеомикасы малюмат базасындан чиг протеомика малюматларыны къыдырынъыз.Талильге истисалджы тарафындан берильген изотоп темизлигини тюзетюв факторы кирсетильген. Дифференциаль ифаденинъ талили ичюн R -деки лимманы къулланынъыз. Асыл малюмат, малюмат базасында къыдырув нетиджелери, малюмат талиль иш акъымы ве нетиджелери эписи PRIDE шерик хазинеси вастасынен ProteomeXchange альянсында PXD019690 малюмат топламы идентификаторы иле сакълана.
Функциональ аннотациялар талильни зенгинлештире. афталыкъта топлангъан малюмат топламынынъ функциональ аннотация терминлерининъ зенгинлигини бельгилемек ичюн «Инженерлик ёлунынъ талили» (QIAGEN) алети къулланылды (1 рес.). Къыскъадан айткъанда, LC-MS/MS (тандем масса спектрометриясы) малюмат талили иле эльде этильген микъдарий акъсиллер джедвели бойле фильтр критерийлеринен къулланыла: Mus musculus тюр ве фон оларакъ сечиле, категория исе Бенджамини тарафындан зенгинлештирюв ичюн 0,05 я да ондан эксик тюзетильген Р къыйметини косьтере, бу эмиетли сайыла. Бу график ичюн эр бир кластердеки энъ яхшы беш артыкъча категория, тюзетильген Р къыйметине эсасланып, косьтериле. Чокъ t-тест къулланып, Бенджамини, Кригер ве Екутиэлининъ эки басамакълы сызыкълы юксельтюв программасыны (Q = 5%) къулланып, эр бир категорияда белли этильген муим намзетлер узеринде вакъыт кечювиндеки акъсиллернинъ экспрессиясы талили япыла, эр бир сыра айрыджа талиль этиле. Изчен СД къабул этмеге керекмей.
Бу чалышманынъ нетиджелерини нешир этильген малюмат базаларынен тенъештирмек ве 1 рес-деки Венн диаграммасыны мейдангъа кетирмек ичюн, биз микъдарий акъсиллер джедвелини MitoCarta 2.0 аннотацияларынен бирлештирдик (24). Схеманы мейдангъа кетирмек ичюн «Венн диаграммасыны сыз» (http://биоинформатика.psb.ugent.be/webtools/Venn/) онлайн алетини къулланынъыз.
Протеомик талиль ичюн къулланылгъан статистик процедуралар акъкъында тафсилятлы малюматны «Материалы и методы» китабынынъ уйгъун болюгинден алмакъ мумкюн. Къалгъан бутюн теджрибелер ичюн тафсилятлы малюматны уйгъун эфсанеден тапмакъ мумкюн. Башкъа шей косьтерильмеген олса, бутюн малюматлар орталама ± СЭМ оларакъ ифаделенген, бутюн статистик талиль исе GraphPad Prism 8.1.2 программасы ярдымынен япылды.
Бу макъаленинъ къошма материалларыны http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/35/eaba8271/DC1 адресинден алмакъ мумкюн.
Бу Creative Commons Attribution-Non-Commercial License шартларына коре даркъалгъан ачыкъ иришильген макъаледир, о, эр бир муитте къулланмагъа, даркъатмагъа ве чокълаштырмагъа имкян бере, тек сонъки къулланув тиджарет къазанчы ичюн олмаса ве премема асыл эсернинъ догъру олгъаны олса. Атыф.
Ишарет: Биз тек сизден почта адресинъизни бермеге риджа этемиз, сиз саифеге тевсие этеджек адам сиз почтаны корьмеге истегенинъизни ве бу спам олмагъаныны бильсин. Биз ич бир почта адресини запт этмейджемиз.
Бу суаль сизнинъ мусафир олгъанынъызны тешкермек ве автоматик спам ёлланмасынынъ огюне кечмек ичюн къулланыла.
Э. Мотори, И. Атанасов, С. М. В. Кочан, К. Фольц-Донаху, В. Сактхивелу, П. Джавалиско, Н. Тони, Дж. Пуял, Н.-Г. Ларсон
Дисфункциональ нейронларнынъ протеомик талили нейродегенерациягъа къаршы турмакъ ичюн метаболизм программалары фаальлешкенини косьтере.
Э. Мотори, И. Атанасов, С. М. В. Кочан, К. Фольц-Донаху, В. Сактхивелу, П. Джавалиско, Н. Тони, Дж. Пуял, Н.-Г. Ларсон
Дисфункциональ нейронларнынъ протеомик талили нейродегенерациягъа къаршы турмакъ ичюн метаболизм программалары фаальлешкенини косьтере.
©2020 Илимнинъ илерилеви ичюн Америка бирлешмеси. бутюн акълар сакълангъан. АААС - ХИНАРИ, АГОРА, ОАРЕ, ХОР, КЛОКСС, КроссРеф ве САЙЧЫКЪнынъ шериклеридир. Илимнинъ илерилеви ISSN 2375-2548.