Шимди†Шимдики адрес: OX11 0DE, Буюк Британия, Даймонд Билдинг, Харвелл ильмий ве инновация паркы, Диеткот, Оксфордшир, Буюк Британия, Даймонд Лайт Сорс Ко., Лтд., Электрон биологик тасвирлев меркези.
Реакция меркезининъ ярыкъ топлайыджы комплекси 1 (RC-LH1) мор фототроф бактерияларнынъ эсас фотосинтез компонентидир. Биз Rhodopseudomonas palustris осюмлигинден RC-LH1 комплексининъ эки криоэлектрон микроскопия къурулышыны кирсеттик. RC-LH114-W комплексининъ 2,65 Å чешитлик къурулышы RC-ни сарып алгъан 14 алтбирлик LH1 иллелеринден ибарет, оларны W акъикъы узип ташлай, W акъикъы олмагъан комплекс исе RC-нен сарылгъан бутюнлей RC теркибидир. Къапалы 16 алт бирлем LH1 иллеси. Бу къурулышларнынъ тенъештирильмеси RC-LH1 комплексинде хиноннынъ динамикасы акъкъында, шу джумледен RC QB еринде хинонны багълагъанда эвельден белли олмагъан конформацион денъишмелер акъкъында, эм де оларны RC-ге кечирмеге ярдымджы олгъан ярдымджы хинон багъланув ерлерининъ ерлешкен ери акъкъында бильгилер бере. W акъикъынынъ уникаль къурулышы LH1 иллемесининъ къапалмасына маниа ола ве бунынънен хинон/хинолон алмашувыны тезлештирмек ичюн канал яратыла.
Фотосинтез ярдымынен берильген энергия ер юзюндеки деерлик бутюн омюрни девам эттире биле, онынъ кунеш биотехнологиясы ичюн буюк имкяны бар. Глобаль фотосинтезни тешвикъат этмекнен берабер, мор фототроф бактериялар чешит энергия шекиллерини ве метаболизм имкянларыны да косьтере. Олар фотосинтезден къачынып, къаранлыкъта гетеротроф бактериялар шеклинде осье билелер, азот ве углекислый газны беклеп, гидроген чыкъарып, къокъулы бирикмелерни парчалай билелер (1—3). Бу джерьянлар ичюн энергия бермек ичюн ярыкъны тез ве эффектив шекильде химиявий энергиягъа чевирмек керек. Бу джерьян ярыкъны туткъан антенна комплекси ярыкъны озюне синъдирип, туткъан энергияны реакция меркезине (РМ) кечиргенде башлана ве бойлеликнен заряд айырылувы башлана (4 – 7). Мор фототроф бактерияларда фотосинтезнинъ эсас бирлеми 2 типли РК-ден ибарет олып, онынъ этрафында ярыкъ топлайыджы 1-нджи комплекс (ЛН1) бар, олар РК-ЛН1 ядро ​​комплексини тешкиль этелер. LH1 эгри αβ гетеродимерлернинъ массивинден мейдангъа келе, оларнынъ эр бири эки бактериаль хлорофилл (BChl) а молекуласыны ве бир я да эки каротиноидни багълай (8-12). Энъ саде LH1 антеннасы къапалы илледе RC (9-13) ни сарып алгъан 16 я да 17 αβ гетеродимерден ибарет, амма башкъа ядро ​​комплекслеринде трансмембраналы пептидлер этрафтаки LH1 нинъ девамлылыгъыны бозалар , Бойлеликнен, bRC (9-13) арасында хинол/хинол ве цитрохон диффузиясыны тешвикъ этелер ( 13-15 сенелери). Мор фототроф осюмлик Rhodopseudomonas (Rps.) — фотосинтезни дестеклеген энергия ве электронларнынъ кочювини анълай бильген нумюневий организмдир. Рпснинъ биринджи кристалл къурулышы. Palustris RC-LH1 комплексининъ модели RC ола, онынъ этрафында 15 гетеродимер LH1 иллелери бар, оларны «W акъикъы» адлы белли олмагъан акъикъ узип ташлай (14). Сонъра Protein-W RPA4402 оларакъ белли олды, бу учь прогнозлангъан трансмембраналы спираль (ТМС) олгъан характеристика берильмеген 10,5 кДа протеиндир (16). Биз W акъыны кодлагъан rpa4402 генининъ адыны pufW деп денъиштирмеге теклиф этемиз, бу RC-L, M (pufL, pufM) ве LH1α, β (pufA, pufB) алтбирликлерини кодлагъан генлер ичюн къулланылгъан номенклатурагъа келишсин. Меракълысы шунда ки, протеин-W тек RC-LH1-нинъ 10%-ге якъынында бар ве Rps-ни ачыкълай. palustris эки чешит RC-LH1 комплексини чыкъара. Мында биз эки ядро ​​комплексининъ юксек ифаделиликли крио-ЭМ (крио-ЭМ) къурулышлары акъкъында хабер этемиз, бириси W ве 14 αβ гетеродимерли, экинджиси исе W акъикъсыз ве къапалы 16 Гетеродимер LH1 иллеси бар. Бизим къурулышымыз Rps RC-LH1 комплексини анълавда адым денъишювини ифаде эте. palustris, чюнки биз эр бир вариантнынъ бир сой популяциясыны талиль эттик ве эр бир пептидни ве багълы пигментлерни ве оларнен багълы липидлерни ве хинонларны ачыкъ-айдын тайинлемек ичюн етерли чешитликке саипмиз. Бу къурулышларны тенъештирюв шуны косьтере ки, шимдиге къадар башкъа бир RC-LH1 комплексинде раст кельмеген учь ТМН акъикъаты-W хинон/хинолон алмашувыны тезлештирмек ичюн хинон каналыны мейдангъа кетире. Бир сыра консерватив липид ве хинон багъланув ерлери белли этильди ве биз хинон ве РК комбинациясындан сонъ янъы конформацион денъишювни таптыкъ, бу денъишюв оксигенленген фототроф организмлернинъ II (ПСИИ) РК фотосистемасына келишкен ола биле. Бизим тапмаджаларымыз мор фототроф бактерияларнынъ RC-LH1 ядро ​​комплексинде хинон/хинолон багъланув ве алмашув кинетикасы акъкъында янъы бильгилер бере.
Рпс-те расткельген эки комплексни тафсилятлы огренмеге къолайлаштырмакъ ичюн. palustris , биз эр бир RC-LH1 биохимик усулларнен айырамыз. W-эксиклиги олгъан акъсиллернинъ комплекси (бундан сонъ ΔpufW деп адландырыладжакъ) pufW гени олмагъан штаммдан темизленди (16), ве тек бир RC-LH1 комплекси чыкъармакъ мумкюн. W акъсилининъ теркибинде олгъан комплекс штамм тарафындан мейдангъа кетириле. Бу штаммнынъ W акъикъы озь С-узьюнде 10x His бирлеми иле модификациялана, бойлеликнен, W акъикъы олгъан комплексни маденни иммобилизация этип, энъ эксик W акъикъынен эффектив шекильде бирлештирмек мумкюн. Комплекс эффектив шекильде айырыла (16) Якъынлыкъ хроматографиясы (ЯХХ).
рес-де косьтерильгени киби, эки комплексте де LH1 антеннасынен сарылгъан учь ярдымджы RC (RC-L, RC-M ве RC-H) бар. Протеин-W етишмеген комплекснинъ 2,80-А къурулышында 16 αβ гетеродимери корюне, олар RC-ни бутюнлей сарып алгъан къапалы LH1 иллеси мейдангъа кетире, бундан сонъ RC-LH116 комплекси деп адландырыла. Акъ-W-ни къаврап алгъан комплекснинъ 2,65Å къурулышында 14 гетеродимер LH1 бар, оны акъ-W иле узип ташлайлар, бундан сонъ RC-LH114-W деп адландырыла.
(А ве В) Бирикменинъ юзюни косьтерюв. (С ве Г) таякъларда ифаделенген япышкъан пигментлер. (Е ве Ф) Цитоплазма юзюнден козетильген комплекслерде мультфильмлерде косьтерильген пептидлер ве LH1 алтбирликлери бар, олар бель-W аралыгъындан саат тарафындан ракъамлангъан [Rba ракъамландырувына келише]. сфероидлер комплекси (13)]. LH1-α ичюн акъсиллернинъ алтбирлигининъ тюсю сары; LH1-β ичюн акъсиллернинъ алтбирлигининъ тюсю кок; акъсил-W ичюн акъсил къырмызы тюсте; РС-Н ичюн о, лазурит; РС-Л ичюн о, Портакъал; РК-М ичюн, мор тюсте. Кофакторлар таякъларнен, ешиль ренкте BChl ве BPh a молекулалары, мор ренкте каротиноидлер, сары ренкте исе UQ10 молекулалары косьтериле. (G ве H) RC-LH114-W комплексининъ (G) ве RC-LH116 комплексининъ (H) эквивалент регионындаки бель-W аралыгъынынъ буюклештирильген корюниши. Кофакторлар бошлукъны толдурув шеклинде, хелатлы хинон мавы ренкте косьтериле. Акъ-W аралыгъы (G) ресимде кок кесик сызыкънен, LH116 алкъасында хинон/хинолол диффузиясы япкъан кичик тешиклер исе (H) ресимде къара кесик сызыкънен айдынлатылгъан.
рес-де (А ве В) эр бири эки ВЧл ве бир каротиноидни багълагъан LH1αβ гетеродимерлерининъ ачыкъ я да къапалы массивлеринен сарылгъан РК косьтерильген (1, С ве Д рес.). Эвельки араштырмалар Rps LH1 комплекси олгъаныны косьтере эдилер. Спирулина ксантинининъ биосинтез ёлунда бу тюрлерде каротиноидлернинъ къарышыкъ популяциялары бар (17). Лякин спиропирроксантин укюмдар каротиноидтир ве онынъ сыкълыгъы къандырыр. Онынъ ичюн биз спироксантинни бутюн LH1 багъланув ерлеринде моделлемекни сечип алдыкъ. Альфа ве бета полипептидлер къыскъа мембраналы тышкъы регионлары олгъан тек ТМХ-лердир (1 рес., А, В, Е ве Ф). С-узьюнде 17 къалымтынынъ сыкълыгъы козьге чарпмаса да, альфа полипептид эки комплексте де Мет1-ден Ала46-гъадже парчаланды. β полипептид RC-LH116-да Gly4-тен Tyr52-ге, RC-LH114-W-де исе Ser5-тен Tyr52-ге эндирильди. я да 4 N-усть я да 13 С-усть къалымтыларнынъ сыкълыгъы козьге чарпмады (С1 рес.). Кийик типли штаммдан азырлангъан къарышыкъ RC-LH1 комплексининъ масса-спектрометрия талили етишмеген регион бу пептидлернинъ гетерологик парчаланувынынъ нетиджеси олгъаныны косьтере (S1 ве S2 рес.). α-Мет1нинъ N-усть формилляциясы да козьге чарпты (е). Талиль α-пептид fMet1 ден Asp42/Ala46/Ala47/Ala50 къалымтыларындан, β-пептид исе Ser2 ден Ala53 къалымтыларындан ибарет олгъаныны косьтере, бу исе алчакъ араретли ЭМ сыкълыкъ харитасынен яхшы келише.
α-His29 ве β-His36 координациясы БЧллерни бет-бетке эте; эр бир αβ гетеродимер озь къомшуларынен бирлешип, РК этрафында ачыкъ илле (RC-LH114-W) я да къапалы илле (RC-LH116) мейдангъа кетире Экситонларнен къошулгъан пигмент массиви (1, С ве Д рес.). RC-LH114-W 877 нм диапазонынен тенъештирильгенде, RC-LH116 880 нм абсорбция къырмызы ер денъиштирюв 3 нм тешкиль эте (2А рес.). Лякин тёгерек дихроизм спектри деерлик бирдир (2В рес.), бу исе ачыкъ ве къапалы иллелер арасында ачыкъ фаркъ олса да, БЧллернинъ ерли муити пек бенъзегенини косьтере. Сюртюв къырмызы ер денъиштирмеси къапалы илле устюндеки иссилик арекетининъ эксильмеси ве тургъунлыкънынъ артмасы (18, 19), къапалы илленинъ себебинден пигментнинъ къошулувынынъ денъишмеси (20, 21) я да бу эки тесирнинъ бирлешмеси (11) нетиджеси ола биле.
А) Ультрафиолет/корюнген/якъын инфракъырмызы ютув спектри, оларнынъ тёпелери озьлерине келишкен пигментлернен бельгиленген ве 775 нм-деки ВРх тёпесине нормаллештирильген. Б) 805 нм-де БЧл абсорбциясына нормаллештирильген тёгерек дихроизм спектри. (С ве Д) RC-LH114-W комплексининъ (С) ве RC-LH116 комплексининъ (D) вакъыт иле чезильген ютув спектрлеринден сечильген ΔA спектрлери. Яхшы тенъештирмек ичюн бутюн спектрлер 0,2 пс-те −А-нынъ ∆А-сына нормаллештириле. Д) UQ2нинъ чешит концентрациялары олгъанда нурландырувдан сонъ цитохром с2нинъ оксидленюв сурьаты (хаммал малюмат ичюн S8 рес. бакъынъыз). Е) алчакъ, орта я да юксек интенсивликтеки ярыкъ астында осьтюрильген улькелерде (10, 30 я да 300 мкМм-2 с-1) темизленген комплекстеки W ве RC-L бель алтбирликлери ве айырылгъан мембраналарнынъ нисбети. СДС-полиакриламид гель электрофорези ве иммуноанализ ярдымынен акъсиллернинъ севиесини бельгиленъиз (хаммал малюмат ичюн S9 рес. бакъынъыз). Темизленген RC-LH114-W комплексине нисбетен нисбетни бельгиленъиз. Комплекснинъ РС-Л ве бель-В стехиометрик нисбети 1:1 ола.
RC-LH114-W деформациялангъан αβ14 иллемесинде 1-нджи ериндеки БЧллер (1 рес., А, С ве Е) RC биринджи донорына (Р) RC-LH116 эквивалент БХллерге коре 6,8Å якъынджадыр (1 ве рес., В ве S3 рес.); лякин эки комплекснинъ кечиджи ютув кинетикасы RC-LH114-W ве RC-LH116 ичюн къозгъалув энергиясынынъ LH1-ден RC-ге кечюв вакъыт денъишмемезлери 40 ±4 ве 44±3 ps олгъаныны косьтере (2 рес.). , С ве Д, С4 ресими ве С2 джедвели). РК ичинде электрон ёллавда да ич бир эмиетли фаркъ ёкъ (С5 ресими ве онен багълы къошма метин). Биз шубеленемиз ки, LH1 ве RC-P арасында энергия кечюв вакъытынынъ якъын келишмеси эки LH1 иллесиндеки BChl эксериетининъ якъын месафеси, кошеси ве потенциаль энергиясынен багълыдыр. Минималь месафеге етмек ичюн LH1 энергия шекилини араштырмакъ субоптимал ерлерден РК-ге догърудан-догъру энергия кечирювден тездже дегиль, корюне. RC-LH114-W-деки ачыкъ иллели LH1 иллеси де структур талиль ичюн алчакъ арарет шараитлеринде эмиетсиз термик арекетке огърай биле, ода араретинде RC 1 ериндеки βBChls пигментация месафесинден даа узун αβ14 алкъа конформациясы бар.
RC-LH116 комплексинде 32 БЧл ве 16 каротиноид бар, онынъ умумий ерлешмеси исе Thermochromatium (Tch.) pidpidum [Белклернинъ малюмат базасы (PDB) ID 5Y5S (9), Тиорходовибрион IDDC7T9r. (12) ве ешиль сув осюмликлери (Blc.viridis) (ПДБ ИД 6ЭТ5) (10). Тегизленген сонъ αβ гетеродимерлерининъ ерлешювлеринде тек кичик сапмалар козьге чарпты, хусусан 1-5, 15 ве 16 (С6 рес.). Акъ-W нинъ олмасы LH1нинъ къурулышына буюк тесир эте. Онынъ учь ТМХ-сы къыскъа иллелернен багълангъан, комплекснинъ люмен тарафында N-усть, цитоплазма тарафында исе С-усть ерлешкен (1А ве 3 рес., А-дан Д-гедже). Протеин-W эсасен гидрофоб ола (3, В рес.), ТМН2 ве ТМН3 исе LH1αβ-14 иле тесирлешип, трансмембраналы юзюни мейдангъа кетире (3 рес., В ве Е дан Г гедже). Интерфейс эсасен трансмембраналы региондаки Phe, Leu ве Val къалымтыларындан ибарет. Бу къалдыкълар гидрофоб аминокислота ве αβ-14 пигментлеринен джыйылгъан. Тесирлешювге базы поляр къалдыкълар да къошула, шу джумледен муреккеп бошлукъ юзюндеки W-Thr68 ве β-Trp42 арасындаки гидроген багъы (3 рес., F ве G). Цитоплазма юзюнде Gln34 αβ-14 каротиноидлернинъ кето группасына янаша ерлешкен. Бундан гъайры, н-додецил β-d-мальтозид (β-ДДМ) молекуласы чезильди, онынъ гидрофоб къуйругъы протеин-W ве αβ-14 арасындаки сынъыргъадже узана, липид къуйругъы исе организмде ерлешкен ола биле. Биз де W ве RCH акъсиллерининъ С-усть чешитлик регионлары пек якъын олгъаныны, амма специфик тесирлешювлерни шекиллендирюв сынъырларында олмагъаныны къайд эттик (1 рес., А ве Е). Лякин бу эки акъсилнинъ чезильмеген С-усть аминокислоталарында тесирлешювлер ола биле, бу исе RC-LH114-W комплексининъ джыйылма вакътында акъ-W чалышув механизмини темин эте биле.
А) Мультфильм шеклинде LH1αβ14 иле интерфейске къаршы тургъан Protein-W электростатик потенциал диаграммасынынъ бир къысмында косьтерильген (контур севиеси 0,13 олгъан шеффаф боз юзю) таякъ шекилли ян зынджырына малик (къырмызы). Б) Гидрофоб ренкли юзюнен косьтерильген бельги-W. Къутуплы ве зарядлы ерлер лазурит, гидрофоб ерлер беяз, кучьлю гидрофоб ерлер исе порталакъ ренкте косьтериле. (С ве Д) Мультфильмде косьтерильген Протеин-W, онынъ ёнелиши (А) (С) тасвириндеки киби, ве 180° айландырылгъан (Д). Сырадаки ерлешювине коре айырылып тургъан къалдыкълар кок къушагъы ренк схемасыны къабул этелер, мында N-усть мавы, С-усть исе къырмызы ола. Д) Протеин-W (А) ресимдеки киби корюниште, протеин-W:LH1 юзюндеки къалдыкълар исе япыштырылгъан бельгилернен таякъларнен косьтериле. (Е) Протеин-W мультфильм тасвиринде (Е) ве LH1αβ14 нисбетен, штанга тасвиринде исе интерфейс къалдыкъларына нисбетен 90° айландырыла. Бета-полипептидтен асылып тургъан къалдыкълар бельгилене. Кофактор 1 рес-деки ренкке келишкен панель шеклинде, парчалангъан β-ДДМ боз ренкте, оксиген исе къырмызы ренкте косьтериле. (Ж) (Е) ресимдеки корюниш 180° айландырылгъан, анда бельгиленген альфа-полипептиднинъ къалдыкълары козьге чарпа.
Протеин-W αβ гетеродимерининъ ерини ала (1Ф рес. 15-нджиси), ве бойлеликнен илленинъ къапалмасына ве биринджи учь αβ гетеродимернинъ эгильмесине маниа ола. Биринджи αβ-1 гетеродимерининъ пленка нормальге нисбетен энъ буюк эгильме кошеси 25°-ден 29°-гъадже олгъаны козьге чарпты (1 рес., А ве Е), бу коше αβ-1нинъ 2°-ден 8°-ге къадар эгильмесинен РК А кескин контраст-LH116 ве F1, В рес.) пейда олды. Экинджи ве учюнджи гетеродимерлер 12° — 22° ве 5° — 10° эгильгенлер. РК-нинъ стерик маниалыгъы себебинден αβ-1нинъ эгильмеси αβнинъ экинджи чифтини къабул этмей (бу 1Ф ресимдеки 16-нджы αβ-ге келише), бойлеликнен LH1 алкъасында ачыкъ аралыкъ пейда ола (1 рес., А ве Е) . Эки αβ гетеродимери олмагъанындан, дёрт БЧл ве эки каротиноиднинъ гъайып олувынен берабер, каротиноидлернинъ ич бириси бурюльген αβ-1 алтбирлигине багъланмай, нетиджеде 13 каротиноид Вегетариан ве 28 БЧл олгъан LH114-W алкъасы пейда ола. αβ1-ден 7-гедже регионлардаки эки комплекснинъ ерли чешитлик къыйметлери LH1 иллемесининъ къалгъан къысмындан эксиктир, бу исе RC QB ерине янаша олгъан LH1 алтбирлигининъ табиий пластичлигини акс эте биле (4 рес.) .
RC-LH114-W (А ве В) ве RC-LH116 (С ве Д) ресимлери 1 рес-деки айны тёпеден/яндан (А ве В) (А ве С) ве бошлукъ юзюнден косьтерильген.(В ве Д). Ренкли клавишалары сагъ тарафта косьтериле.
Стехиометрик нисбети 1:14 олгъан тек бир башкъа хас ядро ​​комплекси Rhodococcus sphaeroides (Rba.) RC-LH1-PufX димеридир (13). Лякин W ве PufX бельгилерининъ ачыкъ-айдын гомологиясы ёкъ, олар озьлерининъ уйгъун LH1 къурулышларына эмиетли тесир этелер. PufX — бу N-усть цитоплазма домени олгъан бирден-бир ТМХ, о, RC-H алтбирлигининъ (13) цитоплазма тарафынен Rps-ке келишкен ерде тесирлешкен. палустриснинъ ЛН116αβ-16 ола. PufX RC-LH1 ве цитохром bcl комплекси арасында хинон/хинолон алмашувы ичюн канал ярата ве бутюн Rba-да бар. сфероидлернинъ озьек комплекси (13). Мономер-мономер интерфейси Rba ерде олса да. Сфероидлернинъ RC-LH1-PufX димери RC-LH114-W ичиндеки W акъикъынынъ багъланув еринде ерлешкен, PufX ве акъикъ-W тарафындан индукция этильген аралыкъ исе эквивалент еринде ерлешкен (S7А рес.). RC-LH114-W ичиндеки бошлукъ да Pseudomonas rosea LH1 гипотезалы хинон каналынен (8) тегизленген, о, W я да PufX бельгисинен багълы олмагъан пептидлер тарафындан мейдангъа кетириле (S7В рес.). Бундан гъайры, Блк-деки хинон каналы. Бир γ алтбирлигини (7) чыкъарып, пейда олгъан зумрут ешиль LH1 де бойле ерде ерлешкен (S7С рес.). Чешит акъсиллер вастасынен олса да, бу хинон/хинолол каналларынынъ RC-LH1 комплексинде умумий ерлешювде пейда олувы конвергент эволюциянынъ мисали олып корюне, бу исе W акъикъы тарафындан яратылгъан аралыкъ хинон каналы оларакъ чалышмакъ мумкюн олгъаныны косьтере.
LH114-W иллемесиндеки аралыкъ RC-LH114-W комплексининъ ички бошлугъы ве джыйма зар арасында, акъсиллерде олгъаны киби, эки доменни акъсиллернинъ тешиги вастасынен багъламакътан зияде, девамлы мембраналы регионны мейдангъа кетирмеге имкян бере (1Г рес.). RC-LH116 комплекси къапалы Тч-ге бенъзей. Инеге бенъзеген комплекс (22) (1Н рес.). Хиноннынъ мембранадан диффузиясы тар акъсил каналындан диффузиядан тездже олгъанындан, ачыкъ LH114-W иллеси къапалы LH116 иллесине коре РК айланувыны тездже япмагъа имкян бере биле, хиноннынъ РК-ге диффузиясы исе даа сынъырлана биле. W бельгиси хинонларнынъ РК ярдымынен чевирильмесине тесир этеми, ёкъмы, тешкермек ичюн биз белли бир концентрацияда убихинон 2 (UQ2) (табиий UQ10 аналогы, изопрен къуйругъы даа къыскъа) узеринде цитохром оксидленюв анализини яптыкъ (2Е рес.). Хелатлы хиноннынъ олмасы корюнген Михаэлис денъишмемезлигини догъру бельгилемеге кедер этсе де (RC-LH114-W ве RC-LH116 0,2±0,1мкМ ве 0,5±0,2мкМ ичюн келише), RC-LH2±0,2мкМ ичюн энъ буюк сурьат RC-LH114-114-0. РС-ЛХ116-дан 28±5% буюктир (3,6±0,1 е-РС-1 с-1).
Биз ильк оларакъ, протеин-W озьек комплексининъ 10%-ге якъынында олгъаныны тахмин эттик (16); мында алчакъ ярыкълы, орта ярыкълы ве юксек ярыкълы осьюв улькелерининъ ерлешюв дереджеси 15±0,6%, 11±1% ве 0,9±0,5 % тешкиль эте (2Ф рес.). Кутьлевий спектрометриянынъ микъдарий тенъештирюви гистидин бирлемининъ къошулмасына коре, кийик типли штаммларгъа нисбетен протеин-Wнинъ нисбий боллугъы эксильмегенини косьтере (Р = 0,59), демек, бу севиелер модификациялангъан протеин-Wнинъ артефакты дегиль (С10 рес.). Лякин RC-LH1 комплексинде W-нинъ бу алчакъ ерлешмеси базы RC-лернинъ тезлештирильген сурьатнен чевирильмесине имкян бере биле, ве бунынънен RC-LH116 комплексинде яваш хинон/хинолон алмашувыны енгиллештире. Биз ярыкънынъ юксек ерлешюв дереджеси якъында транскриптомия малюматларынен келишмегенини къайд эттик, бу исе pufW генининъ экспрессиясы кучьлю ярыкъ астында арткъаныны косьтере (S11 рес.) (23). pufW транскрипциясы ве RC-LH1 комплексине протеин-W кирсетильмеси арасындаки фаркъ къарышыкълыкъ догъура ве протеиннинъ муреккеп низамланувыны акс эте биле.
RC-LH114-W ичинде 6 кардиолипин (КДЛ), 7 фосфатидилхолин (ПОПК), 1 фосфатидилглицерин (ПОПГ) ве 29 β-ДДМ молекуласы айырыла ве онда 6 КДЛ, 24 ПОПК, 2 ПОПГβ ве 12 моделлене. РС-ЛХ116 (5 рес., А ве В). Бу эки къурулышта КДЛ деерлик комплекснинъ цитоплазма тарафында, ПОПК, ПОПГ ве β-ДДМ исе эксериетле люминаль тарафында ерлешкен. RC-LH114-W комплексининъ αβ-1 ден αβ-6 регионында эки липид ве ювгъан мадде молекуласы айырылды (5А рес.), RC-LH116 эквивалент регионында исе беши айырылды (5В рес.). Комплекснинъ дигер тарафында даа чокъ липидлер, эсасен РС ве αβ-7 ден αβ-13 арасында топлангъан КДЛ тапылды (5 рес., А ве В). Дигер къурулыш джеэтинден чезильген липидлер ве ювгъан мадделер LH1 алкъанынъ тышында ерлешкенлер, яхшы чезильген ацил зынджырлары исе LH1 алтбирликлери арасында узана, олар RC-LH114-W-де тахминен β-DDM оларакъ бельгиленген ве RC-де βPOPC-HDL1 ве βPOPC-HD16 А къарышмасында β-DDM оларакъ бельгиленген. Бизим къурулышымызда хелатлы липидлернинъ ве ювгъан мадделернинъ бойле ерлешювлери оларнынъ физиологик джеэттен эмиетли багъланув ерлери олгъаныны косьтере (С12А рес.). Тч ичиндеки эквивалент молекулаларнынъ ерлешювлери де яхшы консистенциягъа маликтир. Муляйим ве Трв. 970 RC-LH1s штаммы (S12 рес., В рес.) (9, 12) ве липид баш группасынынъ гидроген багъланув къалдыкълары сыраларнынъ догърултувында гъает яхшы сакъланувны косьтере (S13 рес.), бу исе RC-ге багълангъан Conserved CDL (24) рес.
(А ве В) RC-LH114-W (А) ве RC-LH116 (В) пептидлери мультфильмлернен, пигментлер исе 1 рес-деки ренк схемасыны къулланып, таякъларнен косьтерильген.Липидлер къырмызы, ювгъан мадделер исе боз ренкте косьтерильген. RC QA ве QB ерлерине багълы UQ сары, айры UQ исе кок тюсте. (С ве Г) (А) ве (В) киби бакъышлар, липидлер къалдырылгъан. (Е дан Г гедже) RC-LH116 дан Q1(E), Q2(F) ве Q3(G) ресимлерининъ кенишлетильген корюниши, ян зынджырлары бири-бирине тесир этелер. Гидроген багълары къара кесик сызыкълар шеклинде косьтериле.
RC-LH116-да заряд айырув джерьянында электронларнынъ кочювинде иштирак этеджек эм RC QA, эм де QB UQ озь багъланув ерлеринде парчалана. Лякин RC-LH114-W-де QB хиноны чезильмеген ве ашагъыда тафсилятлыджа лаф юрсетиледжек. QA ве QB хинонларындан гъайры, RC-LH114-W къурулышында яхшы чезильген баш группаларына коре (сырасынен Q1 ве Q2 ерлешкен) эки хелатлы UQ молекуласы (RC ве LH1 алкъалары арасында ерлешкен) айырыла. кяинат). 5С рес-де). Q1-ге эки изопрен бирлеми тайинлене, сыкълыкъ харитасы исе Q2-нинъ 10 изопрен къуйругъыны толусынен чезе. RC-LH116 къурулышында учь хелатлы UQ10 молекуласы (Q1 ден Q3 гедже, 5D рес.) чезильди ве бутюн молекулаларнынъ бутюн къуйругъы боюнджа ачыкъ сыкълыгъы бар (5 рес., D ден G гедже). Эки къурулышта Q1 ве Q2 хинон баш группаларынынъ ерлешювлери мукеммель консистенциягъа маликтир (S12F рес.), олар тек РК иле тесирлешелер. Q1 RC-LH114-W нинъ W аралыгъынынъ киришинде ерлешкен (1Г ве 5 рес., С, Д ве Е), Q2 исе QB багъланув ери янында (5, С, Д рес.) ве F ерлешкен). Консервациялангъан L-Trp143 ве L-Trp269 къалымтылары Q1 ве Q2-ге пек якъын ве потенциаль π-стекинг тесирлешювлерини темин этелер (5 рес., Е ве F, ве S12 рес.). L-Gln88, Q1 дисталь оксигенинден 3,0 Å узакълыкъта, къавий гидроген багъыны теминлей (5Е рес.); бу къалдыкъ энъ узакъ багъдан гъайры бутюн РК-лерде сакъланып къалгъан (С13 рес.). L-Ser91 дигер РК-лернинъ чокъусында консерватив шекильде Thr ерине къоюла (S13 рес.), Q1 метил оксигенинден 3,8 ангстромдыр ве зайыф гидроген багъларыны темин эте биле (5Е рес.). Q3 специфик тесирлешювге малик олмагъан киби корюне, амма о, RC-M алтбирлиги ве LH1-α 5-тен 6-гъадже алтбирлиги арасындаки гидрофоб регионда ерлешкен (5 рес., D ве G). Q1, Q2 ве Q3 я да якъын ердеки хелатлы хинонлар да Tch-де чезильген. Муляйим, Трв. 970 штамм ве Блк. Ириснинъ къурулышы (9, 10, 12) RC-LH1 комплексинде консерватив ярдымджы хинон багъланув ерини косьтере (S12G рес.). RC-LH116 ичиндеки беш парчалангъан UQ юксек перформанслы сув хроматографиясы (ВЭЖХ) ярдымынен бельгиленген эр бир комплекснинъ 5,8±0,7 ольчюсинен яхшы келише, RC-LH114-W ичиндеки учь парчалангъан UQ исе 6,2±0,3 ольчюсинден эксиктир. теркип.
Псевдосимметрик L ве M полипептидлернинъ эр биринде беш ТМН бар ве олар бир BChl димерини, эки BChl мономерини, эки бактериофаг (BPh) мономерини ве бир Гем олмагъан демирни ве бир я да эки UQ10 молекуласыны бирлештирген гетеродимерни тешкиль этелер. Терминаль кетон группасында гидроген багъларынынъ олмасы ве онынъ Rps-те белли олгъан топланмасы вастасынен каротиноидлер М-алтбирликке кирсетиле, онъа цис-3,4-дегидророродопин ады бериле. Тюрлери (25). РС-Ннинъ тышкъы зар домени заргъа бир ТМН иле бекленильген. Умумий РК къурулышы сойдаш тюрлернинъ (Rba киби) учь алт бирлемли РК-ге бенъзей. сфероидлер (PDB ID: 3I4D) ола. Бу къурулышларнынъ чешитлик диапазонында ВЧл ве ВРх, каротиноид омуз ве гем олмагъан демирнинъ макроцикллери бири-бирине къошулалар, бойле де QA ериндеки UQ10 баш группасы ве RC-LH116 ердеки QB хиноны (S15 рес.).
КБ ерининъ чешит ерлешюв дереджелеринен эки РК къурулышынынъ олмасы КБ хинон багъланувынен берабер олгъан изчен конформацион денъишмелерни тешкермек ичюн янъы имкян бере. RC-LH116 комплексинде QB хиноны толусынен багълы «проксималь» еринде ерлешкен (26), амма RC-LH114-W айырылувында QB хиноны ёкъ. RC-LH114-W ичинде QB хиноны ёкъ, бу тааджиплидир, чюнки комплекс фаальдир, структур джеэттен чезильген QB хиноны олгъан RC-LH116 комплексинден зияде. Эки LH1 алкъасы алтыгъа якъын хинонны хелатласа да, бешиси къапалы RC-LH116 алкъасында къурулыш джеэтинден чезиле, ачыкъ RC-LH114-W алкъасында исе тек учю къурулыш джеэтинден сынъырлана . Бу арткъан къурулыш бозукълыгъы RC-LH114-W QB ерлерининъ тездже денъишювини, комплексте хинон кинетикасынынъ тездже олгъаныны ве LH1 иллемесини кечмек имкянынынъ арткъаныны акс эте биле. Биз бойле теклиф этемиз ки, RC-LH114-W RC QB еринде UQ етишмегени даа муреккеп ве фааль комплекснинъ нетиджеси ола биле, ве RC-LH114-W нинъ QB ери UQ айланувында деръал бузлап къалгъан Специфик басамакъ (QB ерине кириш бу конформациянынъ къапатылгъан) реф.
QB олмаса, L-Phe217 нинъ UQ10 багъланувына келишмеген ерге ёлдашлыкъ япкъан айланмасы, чюнки бу къуйрукънынъ биринджи изопрен бирлеминен фезаий чарпышувгъа себеп оладжакъ (6А рес.). Бундан гъайры, ачыкъ-айдын эсас конформацион денъишмелер ачыкъ-айдын корюне, хусусан, L-Phe217 QB багъланув джебине авуштырылгъан спираль de (ТМХ D ве E арасындаки илленинъ къыскъа спирали) ве L-Tyr223нинъ айланмасы (6А рес.) QB багъланув рамкасынен гидроген багъыны узмек ичюн M- еринде (6В рес.). Озь таянчында Helix de pivots ола, L-Ser209 нинъ Cα 0,33Å, L-Val221Cα исе 3,52Å кочьтиле. ТМХ Д ве Е-де козьге корюнген денъишмелер ёкъ, олар эки къурулышта да устюне къоюла (6А рес.). Биз бильгенимизге коре, бу табиий РК-да КБ ерини къапаткъан биринджи къурулыштыр. Толу (КБ-нен багълы) къурулышнен тенъештирюв хинонны эксильтмезден эвель, оны хинонгъа кирсетмек ичюн конформацион денъишюв керек олгъаныны косьтере. L-Phe217 айланып, хинон баш группасынен π-джыйма тесирини мейдангъа кетире, саргъы исе тышкъа авушып, L-Gly222 скелети ве L-Tyr223 ян зынджыры стабиль гидроген багъ къурулышы олгъан гидроген багъ агъыны мейдангъа кетирмеге имкян бере (6, А ве С рес.).
А) Голограмма (L зынджыры, портъекъайл/M зынджыры, мор) ве апо (боз) къурулышынынъ бир-бирине къоюлгъан мультфильми, анда анахтар къалдыкълары таякъкъа бенъзеген тасвир шеклинде косьтериле. UQ10 сары сызгъычнен косьтериле. Нокъталы сызыкъ бутюн къурулышта пейда олгъан гидроген багъларыны косьтере. (В ве С) Аполипопротеиннинъ ве бутюн алкъа къурулышынынъ юзюнинъ тасвири, L-Phe217 ян зынджырынынъ оксигенини сырасынен мавы, L-Tyr223 исе къырмызы ренкте айдынлата. L алтбирлиги порталакъ тюсте; М ве Н алтбирликлери ренкленмеген. (Д ве Е) Аполипопротеин (Д) ве бутюн (Е) РК КБ ерлери [ренк сырасынен (А) иле] ве Thermophilus thermophilus PSII (ешиль, кок пластик хиноннен; PDB ID: 3WU2) Тегизленъиз (58).
Бекленильмеген алда, LH1 олмагъан QB-эксиклиги олгъан РК-лернинъ бир къач къурулышы олса да, бу тедкъикъатта козьге чарпкъан конформацион денъишмелер акъкъында эвельден хабер этильмеген эди. Буларгъа Blc-ден кельген QB эксильтюв къурулышы да кире. viridis (ПДБ ID: 3ПРК) (27), Тх. тепидум (ПДБ ID: 1ЭЙС) (28) ве Рба. сфаероидлер (PDB ID: 1OGV) (29), оларнынъ эписи озь умумий КБ къурулышынен деерлик бирдир. 3ПРК-ны дикъкъатнен тешкерюв LDAO (Lauryl Dimethyl Amine Oxide) ювгъан мадденинъ молекулалары QB ерининъ киришинде багълангъаныны косьтере, бу исе къапалы конформациягъа янъыдан ерлешювге маниа ола биле. ЛДАО 1ЭЙС я да 1ОГВ-де айны ерде парчаланмаса да, бу РК-лер айны ювгъан мадде къулланып азырлана ве, шунынъ ичюн, айны тесирни косьтермек мумкюн. Рбанынъ кристалл къурулышы. Цитохром с2 (PDB ID: 1L9B) иле берабер кристалллашкъан сфаероидлернинъ РК-си де къапалы КБ ери олгъан киби корюне. Лякин бу алда RC-M полипептиднинъ N-усть регионы (Q спирали устюндеки Tyr къалымтысынынъ H багъы вастасынен QB багъланув еринен тесирлешкен) табиий олмагъан конформацияны къабул эте, QB конформацион денъишмеси исе даа зияде араштырылмай (30 ). Тынчландыргъан шей шунда ки, биз RC-LH114-W къурулышында М полипептиднинъ бу тюр деформациясыны корьмедик, бу RC-LH116 RCнинъ N-усть регионынен деерлик айныдыр. Бундан да гъайры, ювгъан мадде эсасында япылгъан LH1 антеннасы ёкъ этильген сонъ, ПДБ-деки аполипопротеин РК-лери чезильди, бу исе РК ве этрафтаки LH1 алкъанынъ ички юзю арасындаки аралыкътаки ички хинон пулларыны ве липидлерни ёкъ этти (31, 32). РК функциональ къалмакъта, чюнки о, бутюн кофакторларны сакълап къалмакъта, тек парчалангъан QB хинонындан гъайры, о, аз тургъун ве азырлав джерьянында сыкъ-сыкъ гъайып ола (33). Бундан да гъайры, белли ки, РК-дан LH1 ве табиий девирли липидлернинъ чыкъарылма-сы заряднен айырылгъан Р+КБ-алининъ къыскъаргъан омюри киби функцияларгъа тесир эте биле (31, 34, 35). Шунынъ ичюн биз бойле тахмин этемиз ки, РК-ны сарып алгъан ерли LH1 алкъанынъ олмасы «къапалы» КБ ерини сакълап къалмакъ мумкюн, ве бунынънен КБ янындаки ерли муитни сакълап къалмакъ мумкюн.
Аполипопротеин (КБ хинонсыз) ве толу къурулыш бир сыра вакъиалар дегиль де, КБ ерининъ айланувынынъ тек эки левхасыны ифаде этселер де, гидрохинон тарафындан янъыдан багъланувнынъ огюне кечмек ичюн багъланувны къапатмакъ мумкюн олгъаны акъкъында аляметлер бар Субстратнынъ ингибиторлыгъыны ингибирлемек ичюн. Аполипопротеиннинъ КБ ери янында хинолол ве хиноннынъ тесирлешмеси чешит ола биле, бу исе онынъ РК тарафындан ред этильмесине кетире. Хинонларнынъ багъланувында ве азайлувында конформацион денъишмелернинъ ролю олгъаны чокътан теклиф этиле. Бузулгъан РК-лернинъ къаранлыкъкъа уйгъунлашкъан сонъ хинонларны эксильтмек къабилиети бозула (36); Рентген кристаллографиясы бу зарарнынъ QB хинонлары фааль проксималь ерлешювден тахминен 4,5 Å узакълыкъта «дисталь» конформацияда къапкъангъа тюшкенлеринен багълы олгъаныны косьтере (26) , 37). Биз бу дисталь багъланув конформациясы аполипопротеин ве толу алкъа къурулышы арасындаки ара алнынъ бир левхасы олгъаныны теклиф этемиз, бу исе хиноннен башлангъыч тесирлешюв ве КБ ерининъ ачылувындан сонъ ола.
Белли бир фототроф бактериялар ве цианобактериялар, сув осюмликлери ве осюмликлернинъ ПСИИ комплексинде расткельген II типли РК къурулыш ве функциональ сакъланувгъа маликтир (38). рес-де (Д ве Е) косьтерильген къурулыш догърултысы ПСИИ РК ве бактериялы РК комплексининъ КБ ери арасындаки бенъзешювни къайд эте. Бу тенъештирюв чокътан берли хинонларнынъ якъындан багълы олгъан багъланув ве эксильтюв системаларыны огренмек ичюн нумюне олып кельди. Эвельки неширлерде конформацион денъишмелер хинонларнынъ ПСИИ азайлувынен берабер олгъаны акъкъында айтыла эди (39, 40). Демек, РК-нинъ эволюцион сакъланувыны козь огюне алгъанда, эвельден козьге чарпмагъан бу багъланув механизми оксигенленген фототроф осюмликлерде ПСИИ РК-нинъ КБ ерине де къулланыла биле.
Rps ΔpufW (белгисиз pufW делециясы) ве PufW-His (табиий pufW локусындан ифаделенген С-усть 10х His-белгиленген протеин-W) штаммлары. palustris CGA009 акъкъында бизим эвельки ишимизде (16) тасвирленген эди. Бу штаммлар ве изоген кийик типли ана-баба бузлаткъычтан аз сайыда улькелерни ПЕ (эр бири 5 г литр -1) (-80 °С температурада ЛБ-де сакълангъан, теркибинде 50% ( мас./об.) глицерин акъикъы, мая экстракты ве сукцинат (% пла.]в) агар/в.5 устюнде сызып чыкъардылар. Пластинканы анаэроб шараитте ода араретинде къаранлыкъта гедже инкубация эттилер, сонъра OSRAM 116-Вт галоген лампочкалары (RS Components, UK) тарафындан берильген беяз ярыкънен (~50 мкмоль-2 с-1) 3-5 кунь девамында, бир колония пейда олгъандже, ярыкълаттылар. 0,1% (вес/объем) казаминокислоталары (бундан сонъ М22) къошулгъан 10 мл М22+ ортасыны (41) емлемек ичюн бир колония къулланылды. Культураны алчакъ оксиген шараитинде къаранлыкъта 34°С температурада 180 айланув/дакъкъада 48 саат девамында чайкъап осьтюрдилер, сонъра айны шараитте 24 саат девамында 70 мл культураны емледилер. мл универсаль винтли шеффаф джам шишеге 30 мл М22 муитини емлемек ичюн 1 мл колемли ярым аэроб культура къулланыла ве 48 саат девамында стериль магнит кучюнен къарыштырув (~50 мкмольм-2 с-1) иле нурландырыла Stirring rod. Сонъра 30 мл культурагъа айны шараитлерде 1 литрге якъын культура емленди, сонъра бу культура ~200 мкмоль-2 с-1 температурада 72 саат девамында ярыкъландырылгъан 9 литрге якъын культураны емлемек ичюн къулланылды. Уджейрелер 7132 РКФ температурада 30 дакъкъа девамында центрифуга ярдымынен топланды, ~10 мл 20 мМ трис-НСl (рН 8,0) ичинде гъайрыдан суспензияланды ве керек олгъандже -20°С температурада сакъланды.
Ириген сонъ, гъайрыдан суспензиялангъан улькелерге бир къач дезоксирибонуклеаза I (Мерк, Британия), лизоцимнинъ (Мерк, Британия) ве эки Роше голофермент протеаза ингибиторы таблеткасы (Мерк, Британия) кристаллы къошмакъ керек. бинъ функциялы франсыз басымлы улькеде (Аминко, АКъШ) улькелер 8 — 12 кере бозулды. 18500 РКФ температурада 4°С температурада 15 дакъкъа девамында центрифуга ярдымынен сынмагъан улькелерни ве иримейджек къалдыкъларны чыкъаргъан сонъ, 113 000 РКФ температурада 43 000°С температурада 2 саат девамында центрифуга ярдымынен пигментли лизаттан мембрананы чёкюрдилер. Ириген фракцияны ташлап, ренкли мембрананы 100— 200 мл 20 мМ трис-НСl (рН 8,0) ичинде гъайрыдан суспензиягъа къойып, корюнген агрегатлар къалмагъандже гомогенлештиринъиз. Асылгъан мембрананы 20 мМ трис-НСl (рН 8,0) (Anatrace, АКъШ) ичинде 2% (вес/объем) β-ДДМ ичинде 4°С температурада къаранлыкъта 1 саат девамында йымшакъ къарыштырувнен инкубация этелер. Сонъра 70°С температурада центрифугагъа къойып, 4°С температурада 1 саат девамында 150 000 РКФ иритип, къалгъан иримейджек мадделерни чыкъаралар.
ΔpufW штаммындан иритиджи мембрана 50 мл DEAE Sepharose ион алмаштырыджы колонкасына учь колонка колеминде (CV) багълайыджы буфер [20 мМ трис-HCl (рН 8,0) ичинде 0,03% (вес / объем) β-ДДМ] къоюлды. Колонканы эки КВ багълайыджы буфернен ювынъыз, сонъра исе колонканы 50 мМ NaCl олгъан эки багълайыджы буфернен ювынъыз. RC-LH116 комплекси 1,75 КВ устюнде 150-ден 300 мМ NaCl (багъланув буферинде) сызыкълы градиентнен элюирленди, къалгъан багъланув комплекси исе 0,5 КВ устюнде 300 мМ NaCl олгъан багъланув буферинен элюирленди. 250 ве 1000 нм арасындаки ютув спектрини топламакъ, ютув нисбети (А880/А280) 1-ден буюк олгъан фракцияны 880 — 280 нм-де тутмакъ, оны багълайыджы буферде эки кере иритмек ве ДЭАЭ колонкасында кене айны процедураны Темизлев акъкъында къулланмакъ керек. А880/А280 нисбетлери 1,7-ден ве А880/А805 нисбетлери 3,0-ден юксек олгъан фракцияларны иритинъиз, ион алмаштырувнынъ учюнджи турыны япынъыз ве А880/А280 нисбетлери 2,2-ден ве А880/А505 нисбетлери 0-ден юксек олгъан фракцияларны сакълап къалынъыз. Къысмен темизленген комплекс ~2 мл-ге къадар Amicon 100 000 молекуляр агъырлыкълы кесик (MWCO) меркезден къачкъан фильтрде (Merck, UK) концентрацияланды ве Superdex 200 16/600 ольчюдеки чыкъарув колонкасына (GE Healthcare, US) юкленди, онынъ теркибинде NaC m thelume ве 200 буферли буфер бар эди. 1,5 резюме. Ольчю чыкъарув фракциясынынъ ютув спектрлерини топламакъ ве А880/А280 нисбетлери 2,4 ве А880/А805 нисбетлери 5,8 ден 100 А880 зияде олгъан ютув спектрлерини концентрацияламакъ ве оларны деръал крио-ТЭМ сетини азырламакъ я да сакъламакъ ичюн къулланмакъ керек -С°0 къадар тутынъыз.
PufW-His штаммындан иритиджи мембрананы 20 мл HisPrep FF Ni-NTA Sepharose колонкасына (20 мМ трис-HCl (рН 8,0), теркибинде 200 мМ NaCl ве 0,03% (вес/вес)) IMcare буферинде ( GE) къойдылар. в) β-ДДМ]. Колонканы беш КВ ИМАК буферинен, сонъра исе 10 мМ гистидин олгъан беш КВ ИМАК буферинен ювдылар. Озьек комплекси колонкадан 100 мМ гистидин олгъан беш ИМАК буфери иле элюирленди. RC-LH114-W комплексини къаврап алгъан фракцияны Amicon 100 000 МВКО фильтринен (Merck, UK) донатылгъан къарыштырылгъан цистернада ~10 мл къадар концентрациялайлар, багълайыджы буфернен 20 кере иритип, сонъра 25 мл колюмге къошалар. эвельден язылгъан. Колонканы дёрт КВ багълайыджы буфернен ювынъыз, сонъра 0-дан 100 мМ NaCl сызыкълы градиентте секиз КВ устюнде комплексни элюирленъиз (багълайыджы буферде), къалгъан дёрт КВ-де исе 100 мМ багълайыджы буфер нисбети олгъан Къалдыкъ комплекслер натрий8А22 иле элюирленди. 2,4-тен юксек ве А880/А805 нисбети 4,6-дан юксек олгъан фракциялар ~2 мл-ге къадар Amicon 100 000 МВКО меркезден къачкъан фильтрде концентрацияланды ве эвельден 1,5 КВ ИМАК иле толдурылды Буфер мувазенели Супердекс 200 буферинде 16/600 эксклюзиялы буферде ве 16/600 . 1,5 резюме. Ольчю-чыкъарув фракцияларынынъ ютув спектрлерини топла ве А880/А280 нисбетлери 2,1 ве А880/А805 нисбетлери 4,6 дан 100 А880 зияде олгъан ютув спектрлерини концентрацияла, оларны деръал бузлатылгъан ТЭМ сетини азырламакъ ичюн къулланалар я да -80 температурагъадже сакълайлар.
Алчакъ араретли ТЭМ сетлерини азырламакъ ичюн Leica EM GP иммерсион бузлаткъычындан файдаланылды. Комплекс IMAC буферинде 50-ден А880 ольчюсине къадар иритильди, сонъра 5 мкл янъы парылдагъан QUANTIFOIL 1.2/1.3 карбон къапламалы бакъыр сетке (Agar Scientific, UK) юкленди. Сетканы 20°С ве 60% нисбий дымлыкъта 30 с инкубация этинъиз, сонъра 3 с къурутынъыз, сонъра -176°С температурада сувлу этанда сёндюринъиз.
RC-LH114-W комплексининъ малюматлары eBIC (Электрон биовизуализация меркези) (Британиянынъ алмаз ярыкъ менбасы) 300 кВ тезлештириджи кергинликте чалышкъан, 130 000 Choose энергиясы е-2× ве ан Малюмат топламакъ ичюн эсаплав режиминде тасвирлерни язмакъ ичюн К2 тёпе детекторы олгъан Gatan 968 GIF Quantum къулланылды. Калибрленген пиксельнинъ колеми 1,048Å, дозанынъ тезлиги исе 3,83 е-Å-2с-1. саниеде киноны топлап, 40 къысымгъа больди. Микроскопны янъыдан фокусламакъ ичюн карбоннен къаплангъан ерден файдаланынъыз, сонъра эр бир тешикке учь пленка топла- нъыз. Эписи олып 3130 фильм топланды, дефокус къыйметлери -1 ве -3мкм арасында эди.
RC-LH116 комплекси ичюн малюмат айны шу микроскоп ярдымынен Астербери биоструктура лабораториясында (Лидс университети, Буюк Британия) топланды. Малюматлар 130 к буюклештирювнен эсаплав режиминде топланды, пиксельнинъ колеми исе 4,6 е-Å-2s-1 дозасынен 1,065 Å къадар калибрленди. Кино 12 саниеде язылды ве 48 къысымгъа болюнди. Эписи олып 3359 пленка топланды, дефокус дегерлери -1 ве -3мкм арасында эди.
Бутюн малюмат ишлемеси «Релион 3.0» бору ёлунда япыла (42). Доза агъырлыгъы иле нур арекетини тюзетмек ичюн Motioncorr 2 (43) къулланынъыз, сонъра исе CTF (контраст кочюрильме функциясы) параметрини бельгилемек ичюн CTFFIND 4.1 (44) къулланынъыз. Бу башлангъыч ишлев басамакъларындан сонъки типик фотомикрографиялар 2 рес-де косьтерильген.С16. Автоматик сечим шаблоны 250 пиксельли кадрда 1000 парчачыкътан 250 пиксельге якъыныны эльнен сечип алмакъ ве ич бир тюрлю истинадий эки ольчюли (2D) тасниф этмек ёлунен мейдангъа кетириле, ве бойлеликнен нумюненинъ кирленювине джевап берген я да ич бир тюрлю сезильген хусусиетлерге малик олмагъан таснифлер ред этиле. Сонъра, бутюн микрофоторесимлерде автоматик сечим япылды ве RC-LH114-W 849 359 парчачыкъ, RC-LH116 комплекси исе 476 547 парчачыкъ олды. Бутюн сечильген парчачыкълар эки тур истинадий олмагъан 2D таснифтен кечтилер ве эр бир чапувдан сонъ углерод мейданына уйгъун кельген парчачыкълар, нумюненинъ кирленмеси, ачыкъ-айдын хусусиетлери олмагъан я да кучьлю къаплангъан парчачыкълар ред этиле, нетиджеде 772 033 (90,9%) ве 359,6578 Parles for3 тасниф къулланыла ( ) РС-ЛХ114-В ве РС-ЛХ116 ола. Башлангъыч 3D истинадий модел стохастик градиент эниш усулы ярдымынен мейдангъа кетирильди. Башлангъыч моделни истинад оларакъ къулланып, сечильген парчачыкълар 3D шекильде дёрт категориягъа болюнелер. Бу категориядаки моделни истинад оларакъ къулланып, энъ буюк категориядаки парчачыкълар узеринде 3D рафинация япынъыз, сонъра иритиджи мейданыны къапатмакъ ичюн башлангъыч 15Å алчакъ кечиримли фильтрни къулланынъыз, 6 пиксель йымшакъ четлер къошынъыз ве пиксельлерни сонъки ишлевни тюзетинъиз, Gatan K2 transfer funte the Mo. RC-LH114-W малюмат топламы ичюн бу башлангъыч модел масканынъ четлериндеки кучьлю сыкълыкъны (UCSF Chimera-да озьек комплекс сыкълыгъындан айырылгъан) чыкъарып денъиштирильди. Нетиджеде пейда олгъан моделлер (RC-LH114-W ве RC-LH116 3,91 ве 4,16 Å чешитликлери) 3D таснифнинъ экинджи туры ичюн истинад оларакъ къулланыла. Къулланылгъан парчачыкълар башлангъыч 3D сыныфкъа группалангъан ве оларда къомшулыкънен кучьлю корреляция ёкъ. Бир-бирине уймакъ я да ачыкъ-айдын къурулыш хусусиетлерининъ олмамасы. 3D таснифнинъ экинджи турындан сонъ энъ юксек ифаделиликке малик категория сечильди [RC-LH114-W ичюн бир категория 377 703 парчачыкъ (44,5%), RC-LH116 ичюн эки категория бар, джеми оларакъ 260 703 парчачыкъ (4%) the the W. башлангъыч айланувдан сонъ аз фаркънен]. Сайлангъан парчачыкълар 400 пиксельли къутуда янъыдан чыкъарыла ве 3D рафинация ёлунен рафинирлене. Иритиджи маскасы башлангъыч 15Å алчакъ кечиримли фильтр, 3 пиксельли харита кенишлетмеси ве 3 пиксельли йымшакъ маска ярдымынен мейдангъа кетириле. Парчачыкълар башына КТФ рафинациясыны, парчачыкълар башына арекетни тюзетювни ве парчачыкълар башына КТФ рафинациясынынъ экинджи турыны къулланып, алынгъан докъуманы даа да рафинирлемек ичюн эр бир адымдан сонъ 3D рафинация, иритиджилернинъ маскировкасы ве сонъки ишлев япыла. FSC (Фурье къабугъынынъ корреляция коэффициенти) 0,143 кесик къыйметини къулланып, RC-LH114-W ве RC-LH116 сонъки моделлерининъ чешитликлери 2,65 ве 2,80Å тешкиль эте. Сонъки моделнинъ ФСК эгриси 2 рес-де косьтерильген.С17.
Бутюн акъсиллернинъ сырасы ЮниПротКБ-ден юклене: LH1-β (PufB; ЮниПрот ID: Q6N9L5); ЛН1-α (ПуфА; УниПротИД: Q6N9L4); РС-Л (ПуфЛ; ЮниПрот ID: О83005); РК-М (ПуфМ; ЮниПрот ID: А0А4З7); РС-Н (ПухА; УниПрот ID: А0А4З9); Акъ-В (ПуфВ; ЮниПрот ID: Q6N1K3). RC-L, RC-M ве RC-H акъсиллернинъ сырасы ве Rba кристалл къурулышы олгъан RC-нинъ гомология моделини къурмакъ ичюн SWISS-MODEL (45) къулланылды. sphaeroides RC шаблон оларакъ къулланылды (PDB ID: 5LSE) (46). UCSF Chimera программасында «уйгъунлаштырув харита» алетини къулланып, мейдангъа кельген моделни харитагъа келиштиринъиз (47), акъсиллернинъ къурулышыны яхшылаштырынъыз ве кофакторны [4×BChl a (мономер китапханеси къалдыкъларынынъ ады = BCL), 2×BPh a (BPH), бир я да эки чешит UQ10 (U10), бир ieron (iFe олмагъан) 3,4-дигидрогексакарбонилхолин (КАК)] къошмакъ ичюн Кут (48) къулланынъыз. QAK мономер китапханесинде олмагъанындан, оны PHENIX (49) программасында eLBOW алетини къулланып параметрлештирдилер.
Сонъра LH1 алтблок къурулды. Башта PHENIX (49) программасындаки автоматик къуруджылыкъ алети ярдымынен LH1 сырасынынъ бир къысмыны автоматик шекильде харита ве кириш оларакъ LH1-α ве LH1-β акъсиллернинъ сырасы къулланылды. Энъ толу LH1 алтбирлигини сечип алынъыз, оны чыкъарып, Coot ичине юкленъиз, ондаки етишмеген сыраны эльнен къошынъыз ве эки BCls а (BCL) ве бир спириллоксантин (CRT) къошмаздан эвель бутюн къурулышны эльнен темизленъиз [уйгъун Rps-ке коре LH1 комплексининъ сыкълыгъы ве белли олгъан каротиннинъ микъдары. Тюрлери (17)]. LH1 алтбирлигини толусынен кочюрип, UCSF Chimera «Docking Map Tool» ярдымынен LH1 сыкълыгъынынъ янындаки модель олмагъан мейданында док япынъыз, сонъра оны Coot программасында текмилленъиз; бутюн LH1 алтбирликлери моделленмегендже, бу джерьянны текрарламакъ керек. RC-LH114-W къурулышы ичюн, Coot-та айырылмагъан сыкълыкъны чыкъарып, акъсиллер USCF Chimera харитасында къалгъан акъсилсиз компонентлерден сегментлене ве башлангъыч моделни, къалгъан алтбирликлерни (акъсил-W) мейдангъа кетирмек ичюн Autobuild алети къулланыла. ФЕНИКСте (49). Коот (48) программасында пейда олгъан моделге етишмеген сыралар къошып, бутюн алт бирлемни эльнен текмилленъиз. Къалгъан айырылмагъан сыкълыкъ липидлернинъ (CDL = CDL, POPC = 6PL ве POPG = PGT нинъ PDB мономер китапханеси ID), β-DDM ювгъан мадде (LMT) ве UQ10 молекулаларынынъ (U10) комбинациясына келише. Модель статистикасы ве уйгъунлаштырувнынъ корюниш кейфиетини даа да яхшылаштырмакъ мумкюн олмагъандже, бутюн башлангъыч моделни мукеммеллештирмек ичюн PHENIX оптимизациясыны (49) ве Coot (48) программасында эль оптимизациясыны къулланынъыз. Ниает, ерли хаританы кескинлештирмек ичюн LocScale (50) къулланынъыз, сонъра айырылмагъан сыкълыкъны моделлемек ве автоматик ве эльнен япылгъан оптимизациянынъ даа бир къач девирини япынъыз.
озь сыкълыкълары ичинде ерлешкен уйгъун пептидлер, кофакторлар ве дигер липидлер ве хинонлар 1 ве 2 ресимлерде косьтерильген.S18 ден S23 гедже. Сонъки моделнинъ статистик малюматлары S1 джедвельде берильген.
Башкъа шей косьтерильмеген олса, УФ/Вис/НИР ютув спектрлери Cary60 спектрофотометринде (Agilent, АКъШ) 250 нм-ден 1000 нм-гедже 1 нм аралыкъларда ве интеграция вакъытында 0,1с топланды.
Орнекни 1-нинъ А880-ге 2 мм ёлу олгъан кварц кюветада иритинъиз ве 400 — 1000 нм арасындаки ютув спектрини топла- нъыз. Тёгерек дихроик спектрлер Jasco 810 спектрополяриметринде (Jasco, Япония) 400 нм ве 950 нм арасында 1 нм аралыкъларда 20 нм мин-1 сканерлев тезлигинен топланды.
Моляр экстинкция коэффициентини озьек комплексини тахминен 50 ольчюдеки А880-ге къадар иритмек ёлунен бельгилейлер.10 мкл колемни 990 мкл багълайыджы буфер я да метанолда иритмек ве БЧлнинъ парчаланувыны энъ эксик дереджеге еткизмек ичюн деръал абсорбция спектрини топламакъ керек. Эр бир метанол нумюнесиндеки БЧл микъдары 54,8 мМ-1 см-1 771 нм-деки экстинкция коэффициенти иле эсапланды ве экстинкция коэффициенти бельгиленди (51). Ольчевли БЧл концентрациясыны 32 (RC-LH114-W) я да 36 (RC-LH116) гъа болип, озьек комплексининъ концентрациясыны бельгиленъиз, сонъра буферде топлангъан айны нумюненинъ ютув спектрини бельгилемек ичюн къулланыла Экстинкция коэффициенти. мувази. Эр бир нумюне ичюн учь кере текрарлангъан ольчюлер алынды, эсаплав ичюн BChl Qy максимумнынъ орта ютувы къулланылды. 878 нм-де ольчеген RC-LH114-W экстинкция коэффициенти 3280±140 мМ-1 см-1, 880 нм-де ольчеген RC-LH116 экстинкция коэффициенти исе 3800±30 мМ-1 см-1 ола.
UQ10 (52) рес-деки усул боюнджа микъдарджа эсапланды. Къыскъадан айткъанда, «Агилент 1200» ВЭЖХ системасы ярдымынен терс фазалы ВЭЖХ (ТФ-ВЭЖХ) япылды. 0,02 нмоль якъын RC-LH116 я да RC-LH114-W ни 50 мкл 50:50 метанол:хлороформда, теркибинде 0,02% (вес/объем) демир хлорид олгъанда, иритип, эвельден мувазенеге кетирильген Бекман Культер Ультрасфера мм1 мин-1 температурада инъекция этинъиз. 40°С температурада ВЭЖХ иритиджисинде (80:20 метанол:2-пропанол) ×25 см колонкада ерлештириле. 275 нм (UQ10), 450 нм (каротиноидлер) ве 780 нм (BChl) температурада 1 саат девамында абсорбцияны козетмек ичюн ВЭЖХ иритиджисинде изократик элюция япынъыз. 25,5 дакъкъада 275 нм хроматограммадаки пик интеграцияланды, онынъ теркибинде башкъа тапыла бильген бирикмелер ёкъ эди. Интеграль мейданлыкъ 0-дан 5,8 нмольгедже темиз стандартларнынъ инъекциясындан эсаплангъан калибровка эгрисине эсасланып чыкъарылгъан UQ10-нынъ моляр микъдарыны эсапламакъ ичюн къулланыла (S14 рес.). Эр бир нумюне учь текрарлавда талиль этильди, хабер этильген хата орталаманынъ СД-сине келише.
мкМ азартылгъан ат юрегининъ цитохромы с2 (Merck, UK) ве 0-дан 50 мкMUQ2 (Merck, UK) иле 0,1 максималь Qy сорбциясы олгъан RC-LH1 комплекси олгъан эритме азырланды. Эр бир UQ2 концентрациясында учь 1 мл нумюне азырланды ве ольчюден эвель къаранлыкъкъа толусынен уйгъунлашмакъ ичюн 4°С температурада къаранлыкъта гедже инкубация этильди. Иритильген сувны 300 нм атеш/500 сызыкълы решетка, 1,24 мм кириш, 0,12 мм орта ве 0,6 мм чыкъыш тешиклеринен донатылгъан OLIS RSM1000 модуль спектрофотометрине юкледилер. Къозгъалыш ярыгъы чыкъарылмасын деп, нумюне фототрубкасынынъ ве истинадий фотоарттыргъыч трубкасынынъ киришинде узунлыгъы 600 нм олгъан кечирюв фильтри къоюла. Абсорбцияны 550 нм-де 0,15 с интеграция вакътынен козеттилер. Къозгъалыш ярыгъы 880 нмлик M880F2 светодиодындан (Thorlabs Ltd., UK) 90% интенсивликте оптик-лифли кабельден DC2200 контроллери (Thorlabs Ltd., UK) вастасынен чыкъарыла ве ярыкъ менбасына90° кошеде чыкъарыла. Ольчю нурлары кузьгюге къаршы къоюлгъан, нумюненинъ башта озьлерине синъдирильмеген эр бир ярыкъны къайтармакъ ичюн. с ярыкъландырувдан 10 с эвель абсорбцияны козетинъиз. Сонъра хинолол цитохром с23 + озь-озюнден не дереджеде эксильгенини къыймет кесмек ичюн къаранлыкъта 60 с девамында абсорбцияны даа да козеттилер (хаммал малюматлар ичюн S8 ресимге бакъынъыз).
Малюматлар 0,5-10 с ичинде сызыкълы башлангъыч сурьатны (UQ2 концентрациясына коре) уйдурып ве эр бир UQ2 концентрациясында эр учь нумюненинъ сурьатларыны орталамалаштырув ёлунен ишленди. Уйгъун экстинкция коэффициенти иле эсаплангъан RC-LH1 концентрациясы темпни каталитик эффективликке чевирмек ичюн къулланылды, Origin Pro 2019 (OriginLab, АКъШ) графикинде сызылды ве корюнген Км ве Ккат къыйметлерини бельгилемек ичюн Михаэлис-Ментен моделине уйдурылды.
Кечиджи ютув ольчюлери ичюн RC-LH1 нумюнеси 50 мМ натрий аскорбат (Merck, АКъШ) ве 0,4 мМ Тербутин (Merck, АКъШ) олгъан IMAC буферинде ~2 мкМ къадар иритильди. Аскорбин кислотасы къурбан электрон доноры оларакъ къулланыла, трет-бутаклофен исе бутюн ольчю джерьянында эсас РК доноры редукциялангъан (яни фотооксидленмеген) алда къалмасы ичюн QB ингибиторы оларакъ къулланыла. Лазер ёлундаки нумюненинъ къозгъалув импульслери арасында къаранлыкъкъа уйгъунлашмакъ ичюн етерли вакъыт олсун деп, оптик ёл узунлыгъы 2 мм олгъан махсус айланув улькесине (диаметри 0,1 м якъын, 350 айланув/дакъкъа) тахминен 3 мл нумюне къошула. Ti: Sapphire лазер системасыны (Spectra Physics, АКъШ) къуветлештирмек ичюн ~100 фс лазер импульслерини къулланып, 880 нм-де 1 кГц текрарлав тезлигинде (НИР ичюн 20 нДж я да Вис ичюн 100 нДж) нумюнени къозгъамакъ мумкюн. Малюмат топламадан эвель, нумюнени 30 дакъкъагъа якъын къозгъалыш ярыгъына къоймакъ керек. Экспозиция КА инактивациясына себеп оладжакъ (ихтимал, КА бир я да эки кере эксильтеджек). Амма дикъкъат этинъиз ки, бу джерьян кери къайтарыла, чюнки узун бир къаранлыкъ уйгъунлашув девиринде РК яваш-яваш КА фаалиетине къайтаджакъ. -10 ден 7000 пс кечикюв вакъты олгъан кечиджи спектрлерни ольчемек ичюн Helios спектрометри (Ultrafast Systems, АКъШ) къулланылды. Малюматлар топламларыны группадан айырмакъ, сонъра бирлештирмек ве стандартлаштырмакъ ичюн Surface Xplorer программасы (Ultrafast Systems, АКъШ) къулланынъыз. Парчаланувнен багълы дифференциаль спектрлерни алмакъ ичюн комбинирленген малюматлар топламыны къулланмакъ ичюн CarpetView программа пакетини (Light Conversion Ltd., Литва) къулланынъыз я да OriginLa (Originb) программасындаки бир далгъалы спектраль эволюциягъа келишмек ичюн алетнинъ джевабынен бир къач экспонентлерни къаплап алгъан функцияны къулланынъыз.
Юкъарыда къайд этильгени киби (53), теркибинде эм РК, эм де периферик LH2 антеннасы олмагъан LH1 комплекси олгъан фотосинтез пленкасы азырланды. Мембрананы 20 мМ трис (рН 8,0) иле иритип, сонъра 2 мм оптик ёлу олгъан кварц кюветке юкледилер. нДж лазер импульси ярдымынен нумюнени 540 нм-де -10 ден 7000 пс кечиктирюв вакътынен къозгъадылар. Малюматлар топламыны Рпс ичюн тариф этильгени киби ишленъиз. пал нумюнеси.
Мембрана 150 000 РКФ-де 4°С-те 2 саат девамында центрифуга ярдымынен пеллетленди, сонъра онынъ 880 нм-деки абсорбциясы 20 мМ трис-НСl (рН 8,0) ве 200 мМ NaCl ичинде гъайрыдан суспензияланды. 2% (вес/объем) β-ДДМ-де 4°С температурада къаранлыкъта 1 саат девамында яваш-яваш къарыштыра-къарыштыра, зарны иритинъиз. Проба 100 мМ триэтиламмоний карбонатында (рН 8,0) (TEAB; Merck, UK) 2,5 мг мл-1 акъсил концентрациясына къадар иритильди (Bio-Rad анализи). Илеридеки ишлев эвель нешир этильген усулдан (54) япылды, 50 мкг акъсилни джеми 50 мкл ТЭАБ-къа, теркибинде 1% (вес/объем) натрий лаураты олгъан (Merck, UK) иритювден башлап. с девамында ультрасеснен чалыштырылгъан сонъ, оны 37°С температурада 30 дакъкъа девамында 5 мМ трис(2-карбоксиэтил)фосфин (Merck, UK) иле эксильттилер. S-алкиллемек ичюн нумюнени 10 мМ метил S-метилтиометансульфонат (Merck, UK) иле инкубация этелер ве ода араретинде 10 дакъкъа девамында 200 мМ изопропанол махсулат иляджындан къошалар. Протеолит азырлав 2 мкг трипсин/эндопротеиназа Lys-C къарышмасыны (Promega UK) къошып япылды ве 37°С температурада 3 саат девамында инкубация этильди. Лаурат юзюни ачкъан мадде 50 мкл этил ацетат ве 10 мкл 10% (об/об) ЖК сыныфлы трифторсирке кислотасы (ТФА; Thermo Fisher Scientific, UK) къошып, 60 с девамында бурюшик иле чыкъарылды. Фазаларнынъ айырылувына 15 700 РКФ-де 5 дакъкъа девамында центрифуга ярдымынен ярдым эттилер. Истесалджынынъ протоколына коре, ичинде пептид олгъан ашагъы фазаны мукъайтлыкънен аспирация этмек ве тузсызландырмакъ ичюн С18 спин-колонкасы (Thermo Fisher Scientific, Буюк Британия) къулланылды. Вакуум центрифуга ярдымынен къурутылгъан сонъ, нумюне 0,5% ТФА ве 3% атсетонитрильде иритильди ве 500 нг эвельден тафсилятлы тасвирленген система параметрлерини къулланып, масса спектрометриясынен бирлештирильген наноакъымлы РП хроматографиясы ярдымынен талиль этильди.
Акъсиллерни айырды этмек ве микъдарджа эсапламакъ ичюн MaxQuant v.1.5.3.30 (56) къулланып, Rps къыдырынъыз. palustris протеомлары акъкъында малюмат базасы (www.унипрот.орг/протеомлар/UP000001426). Кутьлевий спектрометрия протеомикасы малюматлары PRIDE шерик хазинеси (http://proteomecentral.proteomexchange.org) вастасынен ProteomeXchange альянсында PXD020402 малюматлар топламы идентификаторы алтында ерлештирильди.
Электропульверизатор ионизация масса спектрометриясынен бирлештирильген РПЛК ярдымынен талиль этмек ичюн кийик типли Рпс-лерден РС-ЛХ1 комплекси азырланды. Эвель дердж этильген усулны (16) къулланып, palustris улькелеринде чыкъарылгъан акъсиллернинъ концентрациясы 20 мМ Hepes (рН 7,8), 100 мМ NaCl ве 0,03% (вес/объем) β- (Bio-Rad анализи) ) ДДМ-де 2 мг мл-1 олды. Истесалджынынъ протоколына коре, 2D темизлев комплекти (GE Healthcare, АКъШ) къулланып, чёкюнди усулы иле 10 мкг акъсилни чыкъармакъ керек, чёкюндини 20 мкл 60% (об / об) мурджие кислотасында (ФК), 20% (об / об) Ацетонитрил/ 20% сувда (в) иритмек керек. Беш микролитр масса спектрометриясы (Maxis UHR-TOF, Bruker) иле бирлештирильген РПЛК (Dionex RSLC) ярдымынен талиль этильди. 60°С ве 100мклмин -1 температурада айырмакъ ичюн MabPac 1,2×100 мм колонкасыны (Thermo Fisher Scientific, UK) къулланынъыз, градиенти 85% (об/об) иритиджи А [0,1% (об/об) иритиджи ФА ве 0,02% (об/об) иритиджи]В(об/об) ТФА to(v/v) иритиджи to5 a [0,1%(об/об) ФА ве 0,02%(об/об) 90%(об/об) атсетонитриль ТФА] Стандарт электропульверизатор ионизация менбасы ве стандарт параметрлерни 60 дакъкъадан зияде къулланып, масса спектрометри 100-ден 2750 м/з (масса-заряд нисбети) эльде эте. ExPASy биоинформатика ресурс порталынынъ FindPept алетининъ (https://web.expasy.org/findpept/) ярдымынен кутьлевий спектрни комплекснинъ алт бирлемлерине харитагъа чыкъарынъыз.
Уджейрелерни 100 мл НФ-алчакъ (10 мкМм-2 с-1), орта (30 мкМм-2 с-1) я да юксек (300 мкМм-2 с-1) ярыкъ астында 72 саат девамында осьтюрдилер. М22 ортасы (М22 ортасы, онда аммиак сульфаты къалдырыла ве натрий сукцинат ерине натрий ацетаты къоюла) 100 мл винтли шишеде (23). 30-с беш девирде 0,1 мкм ольчюдеки джам боюнджакъларыны 1:1 колем нисбетинде боюнджакълап, улькелерни лизледилер ве 5 дакъкъа девамында буз устюнде сувуттылар. Иримейджек мадде, сынмагъан улькелер ве джам боюнджакълары 16 000 РКФ температурада 10 дакъкъа девамында скамейкалы микроцентрифугада центрифуга ярдымынен чыкъарылды. Мембрана 20 мМ трис-НСl (рН 8,0) ичинде 40/15% (вес/вес) сахароза градиентли 100 000 РКФ олгъан Ti 70,1 роторында 10 саат девамында айырылды.
Бизим эвельки ишимизде тасвирленгени киби, PufW (16) устюндеки His тегининъ иммунодетекциясы. Къыскъадан айткъанда, 2х SDS юклев буферинде (Merck, UK) темизленген ядро ​​комплекси (11,8 нМ) я да айны концентрациялы РК олгъан мембрана (оксидленюв иле бельгиленген, эксильген фаркъ спектрини чыкъарып, боялангъан гель устюндеки юкни уйдургъан) эки кере иритильди. Акълар 12% бис-трис NuPage гели (Thermo Fisher Scientific, Буюк Британия) копиясы устюнде айырылды. RC-L алтблокыны юклемек ве корьгезмек ичюн Coomassie Brilliant Blue (Bio-Rad, UK) иле гель бояланды. Экинджи гель устюндеки акъсиллерни иммуноанализ япмакъ ичюн метанолнен активлештирильген поливинилиденфторид (ПВДФ) мембранасына (Thermo Fisher Scientific, UK) кечирдилер. ПВДФ мембранасы 50 мМ трис-HCl (рН 7,6), 150 мМ NaCl, 0,2% (об/об) Tween-20 ве 5% (об/об) ягъсыз сют тозунда тыкъылды, сонъра анти-His биринджи антителосынен (буферде Dilute the mH0p 7,6), 150 мМ NaCl ве 0,05% (об/об) Твин-20] 1:1000 А190-114А, Бетил лабораториялары, АКъШ) 4 саат девамында ерлештирильди. дакъкъа девамында антитело буферинде 3 кере ювгъан сонъ, мембрананы хрен пероксидазасы (Sigma-Aldrich, UK) анти-сычан экинджи антителосынен бирлештирдилер (антитело суббуферинде 1:10 000 ольчюде иритильди) W инкубация япылды, тапмакъ ичюн имкян берильди (3 кере ювгъан сонъ 5 дакъкъа антитело хемистраты EESTAR0) («Сианаген», Италия) ве «Амершам Имиджер 600» (GE Healthcare, Буюк Британия) ширкетлери.
Эр бир боялангъан гель я да иммуноанализ ёлакънынъ интенсивлик пайлашувыны сызып, тёпенинъ тюбюндеки мейданны интеграция этип ве RC-L (боялангъан гель) ве Protein-W (иммуноанализ) интенсивлик нисбетини эсаплап, ImageJ (57) ресиминде тасвирни ишленъиз. Бу нисбетлерни, темиз RC-LH114-W нумюнесинде RC-L ве протеин-W нисбети 1:1 олгъаныны фарз этип, бутюн малюмат топламыны онъа коре нормаллештирмек ёлунен моляр нисбетлерге чевирдилер.
Бу макъаленинъ къошма материалларыны http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/3/eabe2631/DC1 адресинден алмакъ мумкюн.
Бу Creative Commons атрибуция лицензиясы шартларына коре даркъалгъан ачыкъ иришильген макъаледир. Макъаледе, асыл эсернинъ керекли шекильде кетирильмеси шартынен, эр бир муитте сынъырсыз къулланмакъ, даркъатмакъ ве чокълаштырмакъ имкяны бериле.
Ишарет: Биз тек сизден почта адресинъизни бермеге риджа этемиз, сиз саифеге тевсие этеджек адам сиз почтаны корьмеге истегенинъизни ве бу спам олмагъаныны бильсин. Биз ич бир почта адресини запт этмейджемиз.
Бу суаль сизнинъ мусафир олгъанынъызны тешкермек ве автоматик спам ёлланмасынынъ огюне кечмек ичюн къулланыла.
Дэвид Дж. К. Суэйнсбери, Парк Цянь, Филип Дж. Джексон, Кейтлин М. Фарис, Дариуш М. Ницвицки, Элизабет К. Мартин, Дэвид А. Фармер, Лорна А. Малоун, Ребекка Ф. Томпсон, Нил А. Рэнсон, Дэниэл П. Каннифф , Марк Дж. Дикман, Дьюи Хитер Холтен, Крист Дж. Дикман, Дьюи Китч Холтен, Крист Хюйл С.
Реакция меркезиндеки ярыкъ тузакъ 1 комплексининъ юксек ифадели къурулышы хинон динамикасы акъкъында янъы малюматлар бере.
Дэвид Дж. К. Суэйнсбери, Парк Цянь, Филип Дж. Джексон, Кейтлин М. Фарис, Дариуш М. Ницвицки, Элизабет К. Мартин, Дэвид А. Фармер, Лорна А. Малоун, Ребекка Ф. Томпсон, Нил А. Рэнсон, Дэниэл П. Каннифф , Марк Дж. Дикман, Дьюи Хитер Холтен, Крист Дж. Дикман, Дьюи Китч Холтен, Крист Хюйл С.
Реакция меркезиндеки ярыкъ тузакъ 1 комплексининъ юксек ифадели къурулышы хинон динамикасы акъкъында янъы малюматлар бере.
©2021 Илимнинъ илерилеви ичюн Америка бирлешмеси. бутюн акълар сакълангъан. АААС - ХИНАРИ, АГОРА, ОАРЕ, ХОР, КЛОКСС, КроссРеф ве САЙЧЫКЪнынъ шериклеридир. Илимнинъ илерилеви ISSN 2375-2548.